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目的：
Hedgehog(HH)信号转导通路广泛存在于胚胎发育不同组织及时期,是胚胎发育过程中的主要调节信号通路之一,在组织的损伤与修复中发挥着开启正常干细胞自我更新的功能。但HH信号转导通路过度激活却可诱使正常干细胞转化成癌干细胞,最终导致癌的发生。众多研究表明该通路与包括白血病在内的多种肿瘤性疾病相关,因此抑制该通路有可能成为肿瘤预防和治疗的新靶点。
Gli作为转录因子,是删信号转导通路的最后一个环节,其下游基因包括多种与细胞增生分化相关的基因,可能是该通路导致肿瘤的关键因素。这些基因包括调节细胞增生和分化的基因,维持细胞生长的基因,促进细胞自我更新的基因,血管生成相关基因,上皮基质转化基因和侵袭基因。这些均提示该通路的活化可能不仅和肿瘤的发生相关,还与肿瘤的复发,转移相关。Gli分子本身与肿瘤细胞的发生发展并没有直接关系,但直接调控肿瘤细胞增殖、分化和转移的分子基因转录水平则受到HH信号通路调控。
最近的研究倾向于其他途径对Gli的非经典激活,发现在有的肿瘤中存在由TGF-β信号通路介导的Gli的非经典激活。TGF-β作为细胞因子,对白血病细胞可以有一系列的影响,包括抑制细胞增殖和诱导分化、改变粘附分子和细胞因子受体表达,以及诱导细胞凋亡等。TGF-β1在TGFβ家系中发现最早,且生物活性最强,在造血调控方面起重要作用。
那么,在白血病中是否同样存在tGF-β信号通路对Gli的调控作用呢?本研究应用TGF-β作用于白血病HL-60和u937细胞株,检测HH通路中Gli1和Gli2的mRNA和蛋白表达的变化,并检测tNF-α以及SIS3对HH通路中Gli1和Gli2的mRNA和蛋白表达的影响,从而证明在白血病HL-60和U937细胞株中同样存在TGF-β信号通路对Gli的调控作用,为白血病发病机制的完善提供新的思路,为白血病的治疗提供新的靶点。
方法：
1、TGF-β对HL-60和U937细胞株Gli1、G1i2表达的影响
(1)0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml TGF-β1分别作用于HL-60和U937细胞24h、48h和72h后,MTT法检测HL-60细胞和U937细胞的增殖情况。(2)5ng/ml TGF-β1作用于HL-60细胞和U937细胞72h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(3)用0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml TGF-β1分别作用于HL-60细胞和U937细胞,时间分别为6h、12h、24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA,检测Gli1和Gli2的表达。(4)5ng/ml TGF-β1、5ng/ml TGF-β1+5μM SIS3分别作用于U937细胞24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA和蛋白,检测Gli1和Gli2的表达。(5)PCR反应判定HL-60细胞和U937细胞是否表达Ptch和Smo基因。(6)5μM SIS3作用于HL-60细胞和U937细胞,时间分别为6h、12h、24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA和蛋白,检测Gli1和Gli2的表达。(7)对照组细胞在不含任何处理因素的1640培养液中培养。(8)ELISA法分别检测正常人血清、HL-60细胞和U937细胞培养上清TGF-β1水平.
2、TGF-β和TNF-α协同作用于HL-60和U937细胞株对Gli1、Gli2表达的影响
(1)5ng/mlTNF-α和0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml TGF-β1分别作用于HL-60细胞和U937细胞24h、48h和72h,MTT法检测HL-60细胞和U937细胞的增殖情况。(2)5ng/mlTNF-α+5ng/mlTGF-β1作用于HL-60细胞和U937细胞72h,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(3)5ng/mlTNF-α作用于HL-60细胞和U937细胞24h。处理结束后收集细胞,提取蛋白,检测TGF-βR I和TGF-β RⅡ蛋白表达。(4)5ng/mlTNF-α作用于HL-60细胞和U937细胞,作用时间分别为12h、24h、48h。处理结束后收集细胞,提取mRNA,检测Gli1和Gli2的表达。(5)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ M SIS3分别作用于HL-60细胞24h;5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5μM SIS3和5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ M SIS3分别作用于U937细胞24h。处理结束后收集细胞,提取mRNA和蛋白,检测Gli1和Gli2的表达。(6)对照组细胞在不含任何处理因素的1640培养液中培养。
结果：
1、TGF-β对HL-60和U937细胞株Gli1、Gli2表达的影响
(1)0.01ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于HL-60细胞24h、48h和72h,对HL-60细胞的增殖没有明显影响:1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于U937细胞24h、48h和72h,U937细胞的增殖受到抑制,并且随时间的延长抑制更加显著。
(2)5ng/ml TGF-β1作用于HL-60细胞和U937细胞72h,U937细胞凋亡细胞百分比明显增加,而HL-60细胞凋亡细胞百分比没有明显变化。
(3)0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/mlTGF-β1分别作用于HL-60细胞6h、12h、24h,各组间及其与对照组间比较,Gli1、Gli2的mRNA表达没有明显差异。
0.1ng/mlTGF-β1作用于U937细胞6h、12h、24h,与对照组比较Gli1、Gli2的mRNA表达没有明显差异;1ng/mlTGF-β1和10ng/mlTGF-β1分别作用于U937细胞6h、12h、24h,从12h起并至少持续至24h,其Gli1、Gli2的mRNA表达较对照组明显减少;而1ng/mlTGF-β1组和10ng/mlTGF-β1组,其组间比较Gli1、Gli2的mRNA表达没有明显差异。
(4)5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5μM SIS3分别作用于U937细胞24h,其Gli1、Gli2的mRNA和蛋白表达与对照组比较:5ng/mlTGF-β1组较对照组降低,而5ng/mlTGF-β1+5μ M SIS3组较对照组明显增高。
(5)HL-60细胞和U937细胞不表达Ptch和Smo基因。
(6)5μ M SIS3分别作用于HL-60细胞和U937细胞6h、12h、24h,其Gli1、Gli2的mRNA表达和蛋白表达与对照组比较:Gli1、Gli2表达较对照组明显增高;并且随着作用时间的延长,差异更加显著。
(7)HL-60和U937细胞的培养上清TGF-β1水平明显低于正常人。
2、TGF-β和TNF-α协同作用于HL-60和U937细胞株对Gli1、Gli2表达的影响
(1)在TNF-α的协同作用下1ng/ml和10ng/ml TGF-β1作用于HL-60细胞和U937细胞24h、48h和72h,HL-60细胞和U937细胞的增殖均受到抑制,并且随时间延长抑制更加显著。
(2)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α作用于HL-60细胞和U937细胞72h,HL-60细胞和U937细胞的凋亡细胞百分比均明显增加.
(3)5ng/mlTNF-α分别作用于HL-60细胞和U937细胞24h,各组与对照组间比较,TGF-β R I和TGF-β RⅡ蛋白表达较对照组增高。
(4)5ng/mlTRF-α分别作用于HL-60细胞和0937细胞12h、24h、48h,各组间及其与对照组间比较,Gli1、Gli2的mRNA表达没有明显差异。
(5)5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μM SIS3分别作用于HL-60细胞24h,其Gli1、Gli2的mRNA和蛋白表达各组间及其与对照组间比较:5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α组较对照组降低,而5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ MSIS3组则较对照组升高。
5ng/mlTGF-β1、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α、5ng/mlTGF-β1+5μ MSIS3和5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α+5μ MSIS3分别作用于U937细胞24h,其Gli1、Gli2的mRNA表达和蛋白表达各组间及其与对照组间比较:5ng/mlTGF-B1组、5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α组均较对照组降低;5ng/mlTGF-β1+5ng/mlTNF-α组较5ng/mlTGF-β1组更低;5ng/mlTGF-β1+5μ MSIS3组和5ng/mlTGF-β1+5ng/m1TNF-α+5μ MSIS3组均较对照组增高。
结论：
1、单独应用TGF-β可以降低U937细胞Gli1、Gli2的表达,对HL-60细胞Gli1、Gli2的表达则没有影响;TGF-β降低U937细胞Gli1、Gli2的表达是通过TGF-β/Smad3途径介导的,可被SIS3所抑制,不依赖于Ptch/Smo途径;HL-60细胞和U937细胞分泌的TGF-β可能降低Gli1、Gli2的表达。
2、TNF-α可以增加HL-60细胞和U937细胞TGF-βRⅠ和TGF-β RⅡ蛋白表达。TNF-α对HL-60细胞和U937细胞Gli1、Gli2的表达没有影响;TGF-β和TNF-α协同作用可以降低HL-60细胞Gli1、Gli2的表达,并可进一步降低U937细胞Gli1、Gli2的表达,且仍可被SIS3所抑制。