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O-GlcNAc (O-linked N-acetylglucosamine)糖基化修饰是一种细胞内动态的蛋白质翻译后修饰。O-GlcNAc糖基转移酶(O-linked N-acetylglucosamine tra nsferase transferase, OGT)以UDP-GlcNAc作为供体底物,将单个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine, GlcNAc)与蛋白质的丝氮酸或苏氨酸的羟基形成O-糖苷键,而这种修饰的去除是由糖苷酶(O-GlcNAcase, OGA)完成的。细胞内超过3000种蛋白具有O-GlcNAc修饰,O-GlcNAc修饰参与了细胞信号转导、配受体相互作用、病毒感染、转录调节、细胞分化、细胞应答以及蛋白质翻译与降解等生物过程。不仅如此,近年来的很多研究结果表明,蛋白质O-GlcNAc修饰的异常与糖尿病、神经退行性疾病、癌症等多种重大疾病的发生有密切关系。人类的基因组中只存在一个编码OGT的基因,其基因表达产物主要有3种OGT亚型,分别为ncOGT (nucleocytoplasmic OGT)、mOGT (mitochondrial O GT)、sOGT(short OGT)。这三种亚型OGT主要的不同是N-末端的TPRs结构,其中,最长的亚型是ncOGT,它的N端包含12个TPRs;较短的亚型是mOGT,它的N端包含9个TPRs,并且有一段信号肽将其定位于线粒体膜内；最短的OGT亚型是sOGT,它仅有2.5个TPRs。但是,这几种OGT亚型的C末端的催化结构域却是相同的。目前,有关O-GlcNAc修饰及OGT的研究进展较慢,其主要原因就是缺少有利的研究工具；因此,为了进一步探讨OGT的生理和病理作用,需制备能高效特异性检测OGT的抗体。因所有三个OGT亚型包含相同的催化结构域,故为制备能够同时有效识别3种OGT亚型的抗体,我们选择了OGT的催化结构域为抗原片段,制备抗OGT-C抗体。为进一步研究mOGT在线粒体中的功能,我们选取mOGT的N末端的特异性氨基酸序列为抗原片段制备能够特异性识别mOGT的抗体,从而为mOGT的研究提供有利的工具。为了制备抗OGT-C抗体,本研究在NCBI数据库中,查找人源OGT基因序列,根据OGT的结构特点,选取OGT的C末端催化结构域中的一段多肽序列(556-1046位点氨基酸)做抗原。我们首先利用基因工程技术成功构建OGT的C末端催化结构域(556-1046)位点氨基酸的重组表达载体pET30-a-OGT-C.转化至大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合His标签的OGT-C蛋白,Ni+珠亲和层析法纯化提取OGT-C蛋白,进一步通过透析、浓缩,最终获得浓度为1 mg/mL的OGT-C重组蛋白溶液。再以OGT-C重组蛋白作为抗原,免疫Wistar大鼠制备多克隆抗体,并用ELISA法检测OGT抗体的效价,Western blotting鉴定抗体特异性。本论文中OGT-C多抗效价达1：80000；在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测重组抗原,并可以特异性检测培养细胞内源表达的ncOGT和mOGT这2种OGT亚型。因此,本论文获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体,在OGT的生物学研究中可以用于检测ncOGT和mOGT的表达。而对于mOGT多克降抗体的制备,则是在GenBank数据库中查找ncOGT、 mOGT和sOGT的序列,利用BioEdit软件对OGT三个亚型的序列进行比对,找到mOGT的特有序列(55个氨基酸的长度)；并选择mOGT N端其中的两个肽段,分别命名为m-1、m-2。合成肽端m-1:MISPSSPPPPNL (mOGT的N-端第14-25个氨基酸),与肽段m-2:SHLLSLTPPKACYL (mOGT的N-端第42-55个氨基酸),应用戊二醛法偶联m-1、m-2与KLH,制备完全抗原,再将该抗原免疫新西兰白兔中制得多克隆抗体,用ELISA法检测其抗体效价,Western bl otting鉴定分析其特异性。本论文中mOGT多抗效价达1：100000：在免疫印迹实验中,此多抗可以高效的检测抗原,并可以特异性识别培养细胞内源表达的mOGT这种OGT亚型。综上所述,本论文依据分子克隆及多克隆抗体制备原理,获得高效价、高特异性的OGT多克隆抗体以及高效价的mOGT多克隆抗体,可以应用于OGT的生物学研究中。