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鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种鸡的急性传染性疾病,通过接触相互传染,各年龄的鸡都可发病,该病在世界范围流行十分广泛,是侵害养鸡业的最严重的传染病之一,被世界动物卫生组织(OIE)列为禽病B类传染病。由于鸡传染性支气管炎病毒(IBV)极易发生变异,经常出现新的血清型,并且不同血清型之间交叉感染现象严重,不同毒株之间基本没有交叉保护力,所以该病的免疫非常困难,鸡群内呈爆发式发生,给养禽业带来巨大的经济损失。本研究对IBV H120株基因序列进行分析,将H120株M基因和N基因构建到真核表达载体中,并对重组质粒的免疫原性进行了研究,为研制IB的DNA疫苗提供依据。1.从GenBank上下载登录号为FJ888351.1的IBV H120型的基因序列,并对其基因序列进行分析,IBV基因组编码的结构蛋白主要有3种,其中N蛋白最为保守,与病毒RNA的合成有关,并且N蛋白上有重要的抗原决定簇;而M蛋白的保守性仅次于N蛋白,可能与核衣壳蛋白结合,决定了病毒的出芽位置,在病毒复制过程中起一定作用,部分抗原决定簇也在M基因上存在。利用PrimerPremier5.0针对IBV-M和IBV-N基因分别设计一对引物,采用RT-PCR试验扩增出具有免疫保护作用的抗原基因M和N基因,通过对这两个基因的测序进行分析发现,IBV-M基因序列含有大约678个碱基,编码225个氨基酸;IBV-N基因序列含有大约1230个碱基,编码410个氨基酸。将其与GenBank上登录的其他毒株进行比较,发现其变异性小,同源率很高,其中IBV-M基因与其他毒株核苷酸序列同源性为84.7%~100%之间,相对应的氨基酸同源性为86%~100%;IBV-N基因与其他毒株核苷酸序列同源性为90.2%~100%之间,相对应的氨基酸同源性为91%~100%之间。2.将扩增出的IBV-M基因和IBV-N基因用EcoRⅠ和SalⅠ进行双酶切,亚克隆到pEGFP-C1-SCP-SEC载体上,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,经菌落筛选和测序,鉴定出正确的阳性克隆,完成真核表达载体的构建。将重组质粒转染到Vero细胞中,进行免疫荧光试验,可以检测到IBV-M基因和IBV-N基因在细胞内表达,并具有一定的免疫原性。这为进一步研究IBV的DNA疫苗提供了理论数据。3.将构建的真核表达载体用脂质体PEI25000按照N/P=8进行包裹,制成核酸疫苗,通过腿部肌肉多点注射进行动物免疫试验,10日龄首免,21日龄加强免疫一次,二免后用IBV H120型毒株进行攻击,连续观察15天后全部扑杀,取肾脏组织进行病毒的检测,其中H120弱毒疫苗组病毒检出率为33.3%,M质粒组病毒检出率为50%,N质粒组病毒检出率为40%,单基因的病毒检出率略高于弱毒苗组,而M+N混合质粒组病毒检出率仅为20%。明显低于弱毒苗组和单基因组。本研究制备的用PEI25000包裹的DNA疫苗,对IB的防控有重要的意义。