论文部分内容阅读
目的:本研究以氚水(HTO)处理体外培养的神经细胞建立细胞受照模型,孕鼠腹腔单次注射氚水建立胎鼠体内照射模型,观察不同浓度氚水照射条件下体外培养神经细胞迁移距离的变化,大鼠神经细胞迁移相关因子如细胞骨架蛋白(F-actin,α-tubulin,tau,MAP2)、神经细胞粘附分子(L1,NCAM)、脑源性神经营养因子BDNF m RNA和细胞外基质糖蛋白Reelin m RNA的表达情况;通过Morris水迷宫实验分析受照仔鼠空间学习记忆能力受损情况,从而探讨氚辐射对神经细胞迁移及大鼠学习记忆能力的影响。方法:(1)神经细胞原代培养出生后1天新生鼠,在无菌条件下取海马,制备1.25×106/ml神经细胞悬液,加入含DMEM/F12(1:1)和B27的培养基中,放置于37℃,5%CO2,饱和湿度的培养箱中。(2)阿糖胞苷处理及细胞分组神经细胞培养第3天后加入终浓度为3ug/ml的阿糖胞苷作用24小时。培养第7天,以0,3.7×102,3.7×103,3.7×104,3.7×105,3.7×106Bq/ml浓度氚水照射神经细胞,照射24h。(3)神经细胞迁移距离测定以Leica AF 6000活细胞工作站测受照神经细胞迁移的距离,活细胞工作站仪器可以自动聚焦,进行单细胞追踪,连续监测8小时,结果使用LAS-AF-Lite 2.3.0软件分析。(4)拉曼光谱分析神经细胞蛋白表达情况使用Xplo RA拉曼光谱分析仪在532nm波长激光激发下光镜观察细胞内蛋白表达分布情况,结果使用Image-Pro Plus(IPP)软件进行分析。(5)实验动物分组及模型制备Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,体重(180-240)g,以雌雄(2:1)的比例随机进行配对合笼,每日8:00观察阴栓。将发现阴栓日定为胚胎第0天(E0),仔鼠出生当日定为出生后第0天(P0)。在胚胎发育第14天(E14)将孕鼠随机分为实验和对照两组(每组各10只),实验组孕鼠单次腹腔注射浓度为3.7×106 Bq/g体液的氚水,对照鼠注射等体积的生理盐水。(6)仔鼠脑组织标本制备于胚胎发育第18天(E18),每组各选取3只孕鼠,每只大鼠经剖腹手术各取6只胎鼠。出生后当天(P0)每组分别处死18只仔鼠,开颅取脑,将脑组织放置在含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液中浸泡固定24小时后切除小脑,使用梯度浓度的乙醇进行脱水,石蜡进行包埋。(7)免疫组织化学染色用En Vision法检测E18胎鼠和P0仔鼠大脑神经细胞F-actin,α-tubulin,tau,MAP2蛋白的表达情况。(8)Western blot检测神经细胞骨架蛋白(F-actin,α-tubulin,tau,MAP2)及神经细胞粘附分子(L1、NCAM)的表达情况。以Quantity-One生物医学图像分析系统进行目的条带半定量分析,各条带累积光密度(Integral Optical Density,IOD)值除以β-actin的IOD值,通过比较各受照组相对强度(relative intensity,RI)值观察蛋白表达的变化情况。(9)RT-PCR半定量检测细胞内BDNF m RNA及Reelin m RNA表达,以QuantityOne生物医学图像分析系统进行半定量分析,将各样品条带IOD值除以β-actin的IOD值,通过比较各受照组相对强度(relative intensity,RI)值观察蛋白表达的变化情况。(10)Morris水迷宫测量仔鼠脑机能出生后38-42天(P38-P42),利用Morris水迷宫进行定向航行训练和空间探索实验,测逃避潜伏期和目标象限停留时间以及目标象限穿行次数,了解仔鼠学习和记忆能力,分析氚辐射对仔鼠学习记忆能力的影响。结果:(1)显微镜下观察发现培养第7天神经元细胞较第3天的胞体饱满,立体感强,折光性好、光晕明显,细胞与细胞之间突起联系更为紧密,胞体及突起表面平滑。(2)迁移距离测定结果显示,受0~3.7×106 Bq/m L浓度氚水照射24小时,神经细胞的迁移距离呈现出浓度依赖性减小,受照细胞迁移距离明显小于对照(p<0.05)。(3)Western blot结果显示,随着氚水浓度的逐渐增大F-actin,α-tubulin,tau,MAP2,NCAM,L1的表达逐渐减弱(P<0.05)。(4)RT-PCR结果显示,不同浓度氚水照射24h后,BDNF m RNA和Reelin m RNA表达量随着氚水浓度的不断增大而逐渐减少。(5)拉曼光谱结果显示,随着氚水浓度的逐渐增大,神经细胞内蛋白信号强度逐渐减弱。(6)免疫组织化学分析结果表明,与对照比,E18及P0实验组大脑海马神经细胞细胞骨架蛋白F-actin,α-tubulin,tau,MAP2表达量均降低(P<0.05)。(7)Morris水迷宫实验证实,受照鼠逃避潜伏期较对照鼠明显延长(P<0.05),而其在目标象限停留时间及目标象限穿行次数明显少于对照(P<0.05),说明氚宫内照射后仔鼠的空间学习记忆能力较对照组明显降低。结论:氚水照射神经元细胞,可使神经细胞骨架蛋白(F-actin,α-tubulin,tau,MAP2)、神经细胞粘附分子(NCAM,L1)、脑源性神经营养因子BDNF m RNA和细胞外基质糖蛋白Reelin m RNA等神经细胞迁移相关分子表达量减少,影响神经元细胞正常迁移,最终导致神经细胞分布异常,从而诱发仔鼠脑机能出现障碍,表现为空间学习记忆能力受损。