雌激素（Estrogen）在生物体内作用广泛,不仅在调节性别特征和生殖功能方面起着不可替代的作用,对神经系统功能如痛觉、学习记忆、运动协调、情感与认知等也有着复杂且重要的影响。在痛觉感受方面,慢性痛敏性疾病如偏头痛、肠易激综合征和间质性膀胱炎等,女性发病率高于男性,且疼痛症状随性激素周期而波动。也有大量文献报导女性对阿片类药物的敏感性低于男性。这些现象都表明雌激素参与痛觉和神经系统阿片信号的调节,但是其中的机制尚不清楚。雌激素的效应由经典的核受体ERα和ERβ以及新近发现的G蛋白偶联型雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor,GPER/GPR30）介导。我们实验室前期工作发现激活延髓头端腹内侧区域的GPR30可显著抑制该区域μ型阿片受体（mu-opioid receptor,MOR）介导的镇痛效应,且这一作用可能与胞内钙信号有关。本研究的目的是利用内源性表达GPR30和MOR的神经细胞株,验证雌激素可能通过GPR30介导的钙信号调节MOR的功能,并利用系统敲除GPR30的小鼠,研究这一信号机制对吗啡镇痛和耐受的调节作用。主要实验方法和结果如下:一、SH-SY5Y细胞内源性表达GPR30和MOR,雌激素通过GPR30介导胞内钙释放和MOR磷酸化1.SH-SY5Y细胞内源性表达GPR30和MOR,雌激素通过GPR30诱导胞内钙增加我们采用qPCR检测了三株神经细胞,分别是人来源的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞、小鼠来源的Neuro-2a细胞和稳定表达人类μ型阿片受体（hMOR）的Neuro-2a细胞,发现SH-SY5Y细胞GPR30mRNA显著高于另两株细胞。Western blot和免疫荧光细胞化学检测显示SH-SY5Y细胞内源性共表达GPR30和MOR。钙成像实验发现E2和G-1（0.1-1μM）浓度依赖性地引起SH-SY5Y细胞钙快速升高,且这一作用可被GPR30特异性阻断剂G15（3μM）抑制,表明雌激素介导的Ca²⁺增加是由GPR30所介导。在Neuro-2a细胞,雌激素和G-1未能引起胞内钙信号。2.GPR30介导的钙信号来源于胞内钙库释放在无钙细胞外液时激活GPR30仍可引起胞内钙离子增加,且和正常细胞外液时并无明显差异,并且非特异性电压依赖性钙通道阻滞剂CdCl₂（200μM）和PKA抑制剂H-89（10μM）不能阻断E2和G-1引起的钙信号增强,提示激活GPR30引起的胞内Ca²⁺浓度增高是由于胞内钙库释放。采用Thapsigargin耗竭胞内钙库后,雌激素和G-1不能引起或引起很小的钙信号反应,进一步说明GPR30引起的胞内钙增加来源于钙库释放。IP3受体抑制剂2-APB、磷脂酶C（PLC）抑制剂U73122可以明显抑制GPR30介导的胞内钙增加,揭示GPR30可能通过PLC-IP3途径导致胞内钙释放。3.钙信号参与雌激素介导的SH-SY5Y细胞c-Fos表达增加通过Western blot的方法观察了雌激素和GPR30选择性激动剂G-1对SH-SY5Y细胞c-Fos表达的影响。0.01μM E2和1μM G-1分别处理SH-SY5Y细胞15、30、60min,可检测到c-Fos的时间依赖性表达增加。G15可以完全阻断雌激素和G-1引起的c-Fos蛋白表达增加。1μM U73122和1μM 2-APB分别预孵育细胞后,也可以阻断雌激素和G-1引起的c-Fos表达。这些结果表明,GPR30激活后,可通过PLC和IP3受体介导的Ca²⁺信号,间接（不通过核受体）介导雌激素的基因组效应。4.激活GPR30可使PKCα和PKCε发生膜转位激活,并使MOR发生磷酸化通过Western blot的方法检测SH-SY5Y细胞质膜上PKCα和PKCε的表达水平,发现E2和G-1（各1μM）分别刺激SH-SY5Y细胞5min后,膜蛋白中PKCα和PKCε表达水平显著提高。E2和G-1（各1μM）分别处理SH-SY5Y细胞,24h后可检测到磷酸化MOR（pMOR）表达水平的显著增加,且可以被PKC抑制剂Ro31180所抑制,揭示GPR30通过PKC导致MOR磷酸化,实现对MOR功能的调控。二、GPR30介导的MOR磷酸化参与吗啡镇痛和吗啡耐受的调控1.GPR30抑制吗啡镇痛在野生型（WT）和系统性敲除Gpr30基因的C57小鼠,采用热痛甩尾（tail-flick,TF）模型,研究了GPR30的激动剂、拮抗剂或基因敲除对吗啡镇痛的影响。在WT小鼠,无论雌性或雄性,GPR30激动剂G-1均可使吗啡镇痛的剂量效应曲线相对于Vehicle组明显右移,而GPR30拮抗剂G15则导致吗啡镇痛的剂量效应曲线明显左移。与G15的效应相一致,Gpr30^-/-小鼠吗啡镇痛的剂量效应曲线较野生型小鼠明显左移。这些结果在整体行为学水平证明了GPR30可抑制吗啡的镇痛效应。在足底注射福尔马林所诱导的急性炎症痛模型,以舔足时间（Licking duration）为痛行为指标,考察了抑制GPR30或敲除Gpr30基因对吗啡（3mg/kg）的镇痛效应的影响。在雌性野生型C57小鼠,G15+吗啡组舔足总时间明显少于Vehicle+吗啡组,表明G15增强了吗啡的镇痛效应。与G15的效应相一致,Gpr30^-/-吗啡组小鼠的舔脚时间也明显少于WT吗啡组小鼠。这些结果在急性炎症痛模型进一步证明了GPR30对吗啡镇痛效应的抑制作用。2.GPR30参与吗啡耐受的形成每日一次皮下注射吗啡（10 mg/kg）建立吗啡耐受小鼠模型,用热痛甩尾潜伏期反映吗啡镇痛效应,观察G15（0.5mg/kg,吗啡给药前预注射,以Vehicle为对照）对吗啡耐受的影响。在Vehicle+吗啡组雌性WT小鼠,吗啡处理开始后的第1-4天（Day 1-Day 4）,TF潜伏期较Day 0（吗啡给药前1天）显著延长,但是自第5天,TF潜伏期开始显著缩短,即吗啡镇痛效应降低（吗啡耐受）。在G15+吗啡组雌性WT小鼠,Day 11才开始出现吗啡镇痛作用的显著降低,表明G15能显著迟缓吗啡耐受的形成。进一步研究系统性敲除Gpr30基因对吗啡耐受的影响。在Gpr30^-/-与WT小鼠,连续7天皮下注射10mg/kg吗啡（对照组注射相同体积的生理盐水）,每天两次,在第1,3,5,7天第一次注射吗啡后测小鼠热痛甩尾（TF）潜伏期,在第8天测定吗啡镇痛的剂量效应曲线。无论雌雄,野生型小鼠自Day 3即出现TF潜伏期缩短,在Day 7,TF潜伏期与Day 0相似,反映吗啡镇痛作用减弱和吗啡耐受形成;Gpr30^-/-小鼠Day 3-Day 7 TF潜伏期虽有一定程度缩短但仍处于较高水平。Day 8测得的吗啡镇痛剂量效应曲线,WT吗啡组相对于WT生理盐水组明显右移,而Gpr30^-/-吗啡组小鼠剂量效应曲线相对于WT生理盐水组没有明显差异。这些结果显示Gpr30基因敲除可显著延缓或抑制吗啡耐受的形成。综上所述,本研究表明,雌激素激活神经细胞的GPR30后,经PLC/IP3信号途径引起胞内钙释放,胞内钙离子增加激活c-Fos蛋白表达和PKCα/ε的膜转位激活,进而使MOR发生磷酸化,抑制MOR的功能。GPR30介导的钙信号及MOR磷酸化抑制吗啡的镇痛效应,促进吗啡耐受的形成。因此,未来有可能靶向GPR30或其下游信号通路设计药物,提高阿片类药物的镇痛效应和延缓或防止吗啡耐受的形成。