乙酸酯类化合物是白酒芳香物质的主要成分,目前清香型白酒发酵主要存在乙酸酯生成量低、发酵周期过长的问题。本文通过同源重组技术,在过表达醇乙酰基转移酶编码基因ATF1的同时敲除了酯水解酶编码基因IAH1,成功构建了高产乙酸酯酿酒酵母重组菌株,并系统地研究了其在改善清香型白酒品质中的应用。主要研究内容如下:(1)以载体pUC19作为基础质粒,IAH1作为同源重组位点,KanMX作为筛选标记,选用强启动子PGK1,构建了重组质粒pUC-IBAPAK。通过PCR扩增出重组盒IA-KanMX-PGK1P-ATF1-PGK1T-IB,将其分别与酿酒酵母单倍体 AY15-a8 和 AY15-α5进行同源重组,得到重组单倍体菌株MY15-a5和MY15-α6。将两株重组单倍体融合得到重组双倍体MY15-1。对亲本菌株AY15和重组菌株MY15-1进行玉米浓醪发酵实验,结果表明:与亲本菌株相比,重组菌株乙酸乙酯生成量提高到1303.2 mg/L,提高了 42.4倍;乙酸异丁酯和乙酸异戊酯生成量分别提高到10.3 mg/L、80.3 mg/L;异丁醇和异戊醇生成量也相应地降低了 21.3%、51.4%,而基本发酵性能无明显变化。(2)利用Cre/loxP系统剔除了重组菌株MY15-1中的KanMX抗性标记,获得了不含外源基因的酿酒酵母菌株MY15,其发酵性能与MY15-1基本一致。将重组菌株MY15应用于清香型大曲白酒发酵中,结果表明:与大曲加亲本菌株AY15相比,大曲加重组菌株MY15在一次发酵结束后乙酸酯总量为317.6 mg/L,提高了 70%,同时高级醇总量下降了 30.1%;二次发酵结束后乙酸酯总量为200.4 mg/L,提高了 24%,同时高级醇总量下降了 16.4%。与纯大曲相比,大曲加重组菌株MY15在一次发酵结束后的乙酸酯总量提高了 2.5倍,同时高级醇总量也提高了 2.9倍;二次发酵结束后的乙酸酯总量提高了 1.4倍,高级醇总量也提高了 1.9倍。(3)将重组菌株MY15应用于清香型麸曲白酒发酵中,研究了原料、配糟比、接种量、发酵时间和酸性蛋白酶对白酒发酵主要酯醇生成量的影响,最终确定了以高粱为原料,配糟比为1:3.6,酵母细胞接种量为2.5×109个/100g,发酵时间为4d,酸性蛋白酶添加量为20 U/g的条件为最佳发酵条件。在该条件下,与亲本菌株AY15相比,重组菌株MY15发酵结束后的乙酸乙酯生成量提高到669.1 mg/L,提高了 31.5倍;乙酸异丁酯和乙酸异戊酯生成量分别提高到6.8 mg/L、60.4 mg/L;乳酸乙酯生成量基本没有变化;异丁醇和异戊醇生成量相应地降低了 21.6%、47.7%。