禽网状内皮组织增生病(reticuloendotheliosis,RE)是由禽网状内皮组织增生病病毒(reticuloendotheliosis virus,REVs)引起的禽类的一种传染性致瘤性疾病。REV主要引起患禽的生长迟缓综合征、免疫抑制及慢性肿瘤。该病毒自1958年首次被分离出来以后,在世界许多国家和地区均有RE发生或流行的报道,我国于1986年在南京首次分离出该病毒。REV主要感染鸡、火鸡、鸭、孔雀、鹌鹑、鹧鸪、雉和珍珠鸡等,其中对REV最易感的动物是火鸡,而鸡是实验室主要研究对象。该病毒的主要传播方式为水平传播,其他传播方式还有垂直传播、虫媒传播以及环境污染物传播等。该病毒的广泛传播会造成多种病毒疫苗免疫失效以及降低动物机体免疫机能从而使其他生物性致病因素,尤其是其他病毒更易感染,进而造成多种病毒的混合感染,导致病鸡大量死亡,给养禽业带来巨大损失。本研究以SPF雏鸡为研究对象,在成功建立SPF雏鸡网状内皮组织增生病病毒感染动物模型的基础上,采用高通量测序以及实时荧光定量PCR检测方法,通过对REV感染SPF雏鸡法氏囊组织中差异表达的miRNA以及其相关靶基因mRNA表达等主要指标动态变化的检测,并结合REV感染SPF雏鸡临诊症状,较全面系统的研究了患RE的SPF雏鸡上述被检指标的动态变化及其对细胞凋亡和肿瘤发生、发展的影响。旨在揭示REV感染SPF雏鸡对miRNA表达的影响,同时研究REV对感染雏鸡法氏囊细胞凋亡及肿瘤相关基因表达的作用,研究主要结果如下:1.REV感染SPF雏鸡疾病模型的建立本研究通过腹腔注射途径,使1日SPF龄雏鸡感染REV,并经感染雏鸡临诊症状的分析、眼观病理变化的观察以及PCR检测等多种手段对雏鸡是否成功感染REV进行判断。结果发现,腹腔注射REV病毒液后,实验雏鸡较相应对照雏鸡精神状态萎靡,背羽凌乱且稀少、进食量明显减少,体重较同日龄的对照鸡显著减轻,表现出典型的生长抑制综合征的症状;剖检实验雏鸡可发现,其法氏囊和胸腺等免疫器官体积明显缩小;然后,再通过PCR对实验雏鸡法氏囊组织进行病毒检测,结果在实验雏鸡法氏囊中成功扩增出REV的特异性保守序列LTR,而同日龄的对照雏鸡则未扩增出该基因。以上各项被检指标均证明通过对易感动物SFP雏鸡进行腹腔注射REV液后,可成功复制出RE雏鸡模型。2.实时荧光定量PCR检测REV方法的建立及其应用迄今为止,已经报道了多种对REV的检测方法,主要包括普通PCR、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光以及环介导等温扩增技术等方法。这些检测方法各有其优势,但也有不足之处。本研究根据REV的LTR基因保守序列建立了荧光定量PCR检测方法,通过优化发现其最适退火温度为57℃,相关系数为R2=0.996753,回归方程:y=32.311-3.142x。应用上述建立的实时荧光定量PCR检测方法,对REV感染SPF雏鸡后第21天和第28天患病雏鸡胸腺、脾脏和法氏囊中病毒含量进行检测。研究发现,在REV感染SPF雏鸡后第21天和第28天患病雏鸡在胸腺、脾脏囊和法氏囊中均可检测到病毒的LTR基因;同时,法氏囊中病毒含量显著高于胸腺和脾脏,而胸腺和脾脏中病毒含量未见统计学差异。3.REV感染SPF雏鸡法氏囊细胞的miRNA高通量测定本研究通过高通量检测技术,对REV感染SPF雏鸡后第21天和28天,其法氏囊中miRNA表达量进行检测,通过数据质量分析发现,检测的各组样品序列长度为0.597G-0.776G,错误率均为0.01%,四组数据中Q20均高于98%,Q30均高于97%,均高于行业标准。GC含量均在50%左右,不会影响测序的进行。对测序数据进行过滤,去除了基因组中影响数据质量的结果后得到的clean reads占总reads的85%以上,并且map到参考基因组的clean reads占总reads的82%以上,以上均说明本次测序结果数据质量良好,可信度较高。对map上的clean reads进行差异表达分析,发现SPF雏鸡感染REV后第21天有63个miRNA表达量发生显著变化,其中有30个miRNA表达量上调,有33个表达量下调;在REV感染SPF雏鸡后第28天有25个miRNA表达量发生显著变化,其中有8个miRNA表达量上调,有17个miRNA表达量下调。4.高通量测序结果验证应用荧光定量PCR方法对高通量测序结果进行验证性检测,分别随机选取了REV感染SPF雏鸡后第21天和第28天的10个上调和下调的差异表达miRNA,并检测了其表达量,并通过相关性分析对比发现,REV感染后第21天和28天实时荧光定量PCR检测的10个差异表达miRNA表达量与高通量测序结果表达量呈正相关,其相关性系数分别为:R2=0.9633和0.9796。证明高通量测序结果准确。5.REV感染引起细胞凋亡的机制研究在REV感染SPF雏鸡后第21天,其法氏囊出现明显的细胞凋亡现象,检测出此时差异表达miRNA靶基因Caspase-6,Caspase-7和P27表达量显著升高,而Mcl-1表达量显著降低,Caspase-6和Caspase-7被认为是细胞凋亡通路的关键性因子,同时抑瘤蛋白P27也具有促进细胞凋亡的作用,均为促凋亡因子,其表达量升高证明细胞凋亡过程被促进;而Bcl家族成员Mcl-1具有抑制凋亡的作用,是典型的抑凋亡因子,其表达量降低也说明细胞凋亡受到促进。同时对靶基因及其调控miRNA表达量进行负相关性分析,发现其具有显著的负相关性,其负相关系数为:R2=0.9533,证明miRNA对预测的靶基因具有调控作用。以上结果显示,REV通过调控miRNA表达促进促凋亡因子m RNA的表达,同时抑制抑凋亡因子表达来引起法氏囊细胞发生细胞凋亡。6.REV感染对肿瘤相关靶基因的影响在SPF雏鸡感染REV后第28天,检测出差异表达miRNA的靶基因CCNA1、CCNB2、CCND3和c-myc的表达量均有不同程度的上调,CCNA1、CCNB2和CCND3均为不同亚型的细胞周期素蛋白,分别在细胞分裂间期发挥促进作用,能够促进细胞凋亡的发生,一般在分裂旺盛的肿瘤细胞中表达量较高;c-myc为原癌基因,其表达量升高能够证明肿瘤的发生或具有明显的发生趋势,同时对上述基因及其miRNA进行负相关性分析,发现其负相关性系数为:R2=0.9533,说明两者具有显著的负相关性。以上结果显示REV通过促进细胞周期素蛋白的表达、以及激活原癌基因来促进癌症的发生。