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煤炭在燃烧过程中会排放出二氧化硫等有害物质,对人体健康、植被、金属、建筑和生态环境都产生不利影响。煤的生物脱硫技术因菌株脱硫能力单一、脱硫效率低等原因,应用受到限制。因此,本文论文以前期已获得的无机硫脱除菌株氧化亚铁硫杆菌L1、有机硫脱除菌株D4为出发菌株,利用基因工程技术,改造微生物的脱硫能力,构建了一株能同时脱除原煤中有机硫和无机硫的工程菌,为生物脱硫的工业化应用提供有意义的参考。主要研究内容及结果包括以下几个方面:1、结合原始菌株L1脱无机硫和D4脱有机硫的能力,建立多菌株两步法脱硫技术,并考察原煤中硫化物的生物沥滤效果。煤中的全硫含量用元素分析仪测定,黄铁矿硫含量和硫酸盐硫含量由国标法(GB/T215-2003)进行测定,原煤脱硫前后经扫描电镜(SEM)、傅里叶红外(FTIR)、X射线衍射(XRD)和热重(TG)等方法分析。结果显示,经两步法生物沥滤后,煤表面出现明显腐蚀痕迹,煤中全硫的脱硫率达到51%,黄铁矿硫脱硫率约为52.1%,有机硫脱硫率达到39.5%,微生物脱硫过程中,煤中的化学键和成分晶形均发生变化,有利于硫分的去除,并且原煤的燃烧热值没有降低,可见两步法生物脱硫可实现对无机硫和有机硫的同时脱除。2、重组复合脱硫酶的表达:首先以L1菌的总DNA作为模板进行PCR扩增,克隆得到脱无机硫酶基因CysH,大小约为783 bp;其次以D4菌的总DNA作为模板进行PCR扩增,克隆获得目的脱有机硫酶基因DszA、DszB和DszC,大小分别为1374 bp,1110 bp,1266 bp。利用OE-PCR扩增技术,连接四段目的基因,得到脱硫酶操纵子DszA-DszB-DszC-CysH,以pET-28a(+)为表达载体构建重组脱硫操纵子表达载体pET-DszA-DszB-DszC-CysH(简写为pET-Dsz-CysH),用电击转化方法将重组表达载体转化受体菌E.Coli BL21(DE3),培养得到一株脱硫基因工程菌E.Coli BL21(DE3-pET-Dsz-CysH)(简称L-D)。3、重组脱硫酶活性研究:经IPTG诱导后,对基因工程菌L-D所表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳检测,在大小为49.5 KDa,44.8 KDa,39 KDa和29.9 KDa的地方出现了较为明显的特异性蛋白条带,与脱硫酶基因DszA、DszC、DszB和CysH所翻译的蛋白大小相符。对重组菌株L-D中CysH所翻译的APS还原酶进行研究,结果显示,APS还原酶的最适温度30℃,最适pH为6。另外,以DBT为底物发现工程菌L-D所表达脱有机硫酶可降解DBT,说明脱有机硫酶正确表达。4、重组复合脱硫酶基因工程菌L-D对原煤脱硫的研究:考察反应温度、转速、pH、反应时间、煤粒度、煤浆浓度和接种量各因素对工程菌L-D脱硫的影响,综合考虑,从脱硫率和脱硫的经济利益综合考虑,确定了实验室条件下工程菌L-D脱硫的最佳条件:摇床转速170 r/min,培养温度30℃,培养基初始pH 6,煤浆浓度6.0%,脱硫时间6 d,接种量为10%,在最佳条件下,工程菌L-D全硫脱硫率达到46%,有机硫脱硫率达到38%,无机硫脱硫率达到62%,脱硫效果最佳,与两步法脱硫效果接近,且工程菌脱硫工艺更简单,操作更便捷。本研究成功构建了一株复合脱硫基因工程菌L-D,并考察了L-D原煤脱硫的脱硫特性和脱硫率及生长特性,得到了其最佳的生长环境和脱硫条件,此研究为煤炭生物脱硫技术的工业化生产提供了有意义的参考。