背景和目的矽肺是由于长期吸入游离二氧化硅(SiO2)粉尘导致的肺组织广泛纤维化,其发生发展是多种细胞、细胞器以及分子共同参与的复杂过程,其中肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化是重要的环节。一般认为,细胞转分化过程中需要消耗能量以满足细胞合成、分泌相关蛋白,而能量的产生则需要线粒体代谢的参与。以往研究证明,在特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺癌等肺部疾病中,均有线粒体形态、功能的变化和影响,但其在矽肺纤维化过程中的状态及作用尚不明确。因此,通过体外构建SiO2粉尘诱导肺成纤维细胞转分化模型,应用激光共聚焦显微镜、Western blot、实时荧光定量PCR等技术,观察转分化过程中线粒体功能改变,探索其潜在关联性,为深入了解矽肺发病过程中线粒体的调控作用,进一步阐明矽肺发病机制提供新的思路和参考依据。材料和方法1.材料人胚肺成纤维细胞(MRC-5)和人单核细胞(THP-1)购自中国科学院细胞库。2.方法采用佛波酯(PMA)诱导人单核细胞(THP-1细胞)分化为巨噬细胞,CCK-8实验确定SiO2粉尘染毒浓度。采用qPCR检测不同浓度TGF-β刺激人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)后转分化标志物FN1、COL1、α-SMA等mRNA表达水平,确定TGF-β的染毒浓度。利用Transwell小室构建THP-1细胞诱导巨噬细胞和MRC-5细胞共培养模型,共培养实验分为空白对照组、SiO2染毒组和TGF-β刺激组,分别在染毒0h、24h、48h、72h,用光学显微镜观察细胞形态变化,并采用qPCR、Western blot和免疫组化检测实验前后转分化标志物FN1、COL1、α-SMA等mRNA和蛋白的表达水平。用TGF-β直接刺激MRC-5细胞建立简化模型,确定刺激浓度。对照组和刺激组,分别在染毒0h、24h、48h、72h,于光学显微镜下观察细胞形态变化,采用qPCR和Western blot检测实验前后转分化标志物FN1、COL1、α-SM4等mRNA和蛋白的表达水平。对上述各实验组,使用罗丹明123试剂盒检测线粒体膜电位改变、Mito SOX Red检测线粒体活性氧(ROS)水平、ATP试剂盒检测线粒体ATP水平、Western blot检测线粒体标志性蛋白和自噬相关蛋白的表达、qPCR检测VDAC、TOM40、COX4等线粒体标志蛋白mRNA水平。3.统计学分析应用SPSS21.0对所得数据进行统计学分析。计量资料经正态性检验符合正态分布时,结果以均数±标准差(X±S)表示。两组独立样本间的均数比较采用两独立样本t检验。多组间均数差异的比较采用单因素方差分析,方差齐时,组间两两比较采用LSD-t检验,方差不齐时采用Dunnett-t检验。检验水准α=0.05。结果1.肺成纤维细胞转分化模型建立及观察在共培养模型中,选择150μg/ml SiO2染毒浓度和5ng/ml TGF-β染毒浓度进行实验。染毒0h空白对照组、SiO2染毒组和TGF-β刺激组细胞形态一致,转分化标志物FN1、COL1、α-SMA等mRNA和蛋白的表达差异无统计学意义;染毒24h、48h、72h,与空白对照组相比,SiO2染毒组和TGF-β刺激组,MRC-5细胞形态均发生变化,FN1、COL1、COL3、CTGF、SERPINE1、VCAN、α-SMA等mRNA表达量随着时间升高,FN1、COL1、α-SMA等蛋白表达量在24h有所升高,48h时升高最为明显,72h又有所降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。TGF-β直接刺激实验中,与对照组相比,刺激MRC-5细胞0h、24h、48h、72h后,TGF-β刺激组细胞形态无明显变化。刺激24h、48h、72h后,FN1、COL1、COL3、CTGF、SERPINE1、VCAN、α-SMS等 mRNA 表达量与 FN1、COL1、α-SMA等蛋白表达量均随着时间升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.成纤维细胞转分化过程中线粒体基本功能及相关分子表达水平在共培养模型中,与空白对照组相比,SiO2染毒组和TGF-β刺激组线粒体膜电位增强、ROS水平升高、ATP水平下降,VDAC的mRNA与蛋白表达均升高,TOM40、COX4仅在72h表达降低,且检测到LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。TGF-β直接刺激实验中,与对照组相比,刺激组的膜电势、ROS、ATP以及相关分子的表达水平变化趋势与共培养模型相同,差异也均具有统计学意义(P<0.05)。结论SiO2粉尘和TGF-β体外促使成纤维细胞转分化过程中,细胞线粒体膜电位增强、ROS水平升高、ATP水平下降,部分线粒体标志蛋白稳态发生变化。提示成纤维细胞转分化过程中具有线粒体代谢参与机制。