精氨酸脱亚胺酶(ADI；EC 3.4.3.6)是一种精氨酸降解酶,催化精氨酸生成瓜氨酸。ADI广泛存在于细菌、古细菌、厌氧真核生物中,它是一种治疗精氨酸缺陷型肿瘤(如肝细胞癌、黑素瘤)的药物。本研究室前期从环境中筛选获得一株ADI高产菌株,经鉴定为Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039。前期研究将该变形假单胞菌来源的ADI在大肠杆菌BL21中进行胞内表达,存在包涵体多、纯化分离步骤较繁琐等缺陷。为简化分离纯化并提高该酶作为人类抗癌药的应用潜力,本论文将变性假单胞菌来源的ADI在毕赤酵母和大肠杆菌中分别进行分泌型表达。将来源于变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arcA根据毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,然后将优化后的基因yh-ADI克隆至表达载体pPIC9K。成功构建重组表达载体pPIC9K-yh-ADI。毕赤酵母转化子经96孔板传代培养后,再进行6418筛选获得多拷贝重组子。对酵母重组子诱导条件的初步优化,得到酵母重组子在1%甲醇诱导72 h后ADI活性最高,GS115/pPIC9K-yh-ADI酶活29.0mU/mL。同时为了获得高表达的ADI,还研究了ADI在大肠杆菌中的分泌表达。将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢB中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI。将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’后进行诱导表达,分别考察了诱导物L-arabinose浓度、诱导温度及诱导时间对重组蛋白表达的影响,确定最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002%(w/v),25℃下诱导5 h,全细胞的酶活为68 mU/mL。采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kDa,与理论结果一致。通过ADI在大肠杆菌及毕赤酵母中的分泌表达,得到和天然酶具有相同生物学活性的重组ADI,首次实现原核生物来源的ADI在真核表达系统中的表达。为进一步获得分泌型的重组ADI以及ADI-HSA的融合表达和抗肿瘤研究奠定了理论基础,将有助于推动精氨酸脱亚胺酶更广泛、更深入的应用。