目的：　　胃癌是全世界发病率较高的恶性肿瘤之一，同时也是亚洲国家引起肿瘤相关死亡的主要原因。多数患者在诊断时已经是晚期，5年生存率只有10％-15％。尽管化疗、放疗及靶向治疗的应用提高了晚期胃癌患者的生存率，但绝大多数患者都面临复发和肿瘤转移的风险，中位总生存时间不足12个月。其原因主要归结于胃癌的转移机制不明，且尚无有效的生物标志物预测转移的发生。因此，深入探讨胃癌转移的机制对降低肿瘤复发、控制转移、延长晚期胃癌患者生存时间至关重要。　　肿瘤的转移是一个动态的、多步骤的过程，涉及诸多因子，其机制极为复杂。近年来的研究发现，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transitions，EMT）与恶性肿瘤转移密切相关。EMT是指在某些特殊的生理或病理条件下，具有极性的上皮细胞转变成具有移行能力的间质细胞的过程。研究表明，EMT在包括胃癌在内的多种上皮肿瘤的原位浸润和远处转移中发挥了重要作用。据报道，胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)可与上皮细胞表面的相应受体IGF-ⅠR结合，激活下游PI3K/Akt及MAPK/ERK信号转导通路，影响细胞粘附分子和细胞骨架功能，诱导乳腺癌及前列腺癌细胞发生EMT。此外，胃癌组织中IGF-ⅠR的表达显著高于癌旁组织，且IGF-ⅠR过表达是影响晚期胃癌患者生存的独立预后因素。因此，IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR通路有可能通过诱导EMT促进胃癌的侵袭转移。　　EMT的发生、发展受多种因素的调节，如肿瘤微环境、信号转导通路和转录因子、泛素化、DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA等。泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程，其在蛋白质的定位、代谢、功能调节和降解中都起着十分重要的作用。泛素连接酶Cbl家族是泛素化过程的关键酶。Cbl蛋白包括3个同源体，c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3。近年来的研究发现，泛素连接酶c-Cbl参与了EMT的调控。Cbl-b和c-Cbl有相似的结构和功能。有研究报告，Cbl-b参与了IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR信号通路的调节和EGFR介导的乳腺上皮细胞间粘附连接的破坏。但是Cbl-b是否能调节IGF-Ⅰ/IGF-ⅠR信号通路，并因此参与IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT尚不清楚。　　本实验以人胃癌细胞株MGC803、SGC7901和BGC-823为模型，研究IGF-Ⅰ诱导胃癌细胞EMT、促进肿瘤转移的机制，同时对EMT调控因子Cbl-b在此过程中的调控机制进行了初步探讨。　　材料与方法：　　1、采用倒置显微镜观察细胞形态。　　2、采用Transwell法测定细胞迁移能力。　　3、采用Western blot检测E-cadherin，Vimentin，ZEB1，ZBE2，Snail，Twist2，IGF-ⅠR，p-IGF-ⅠR，ERK，p-ERK，Akt，p-Akt，Cbl-b和Actin蛋白的表达。　　4、采用免疫共沉降技术检测蛋白间的共结合。　　5、采用免疫荧光显微技术观察E-cadherin，Vimentin蛋白的分布。　　6、采用RT-PCR检测ZEB2的mRNA表达水平。　　7、采用Real-time PCR技术检测microRNA-200c的表达水平。　　8、采用GeneChip miRNA Array检测人类microRNA的表达水平。　　9、构建靶向Cbl-b基因的短发夹环RNA(shRNA)真核质粒表达载体，建立Cbl-b shRNA稳定转染胃癌MGC-803细胞系。　　10、免疫组化染色检测胃癌组织标本中IGF-ⅠR与Cbl-b的表达情况。　　11、统计学处理:每次实验重复3次，数据以均值±标准差（(x)±s）表示。采用SPSS13.0统计软件进行t检验、Spearman秩相关检验和Fisher精确计算概率法，P＜0.05有统计学意义。　　实验结果：　　1、IGF-Ⅰ能够诱导胃癌细胞发生EMT　　将MGC803、SGC7901和BGC-823细胞在无血清的培养液中饥饿过夜，加入100ng/mL的IGF-Ⅰ处理48小时。倒置显微镜观察细胞形态。三种细胞从岛状的连接紧密的类圆形细胞转变成长梭形的、连接松散的间质细胞，部分细胞伸出伪足，排列紊乱。荧光显微镜观察到，IGF-Ⅰ处理组的胃癌细胞E-cad蛋白自胞膜向胞浆转位，Vimentin蛋白向细胞一侧或双侧极化聚集。Western blot检测了上皮和间质表型标志物以及相关的核转录因子表达情况。结果发现，与对照组相比，IGF-Ⅰ处理后的细胞E-cadherin(E-cad)显著降低，Vimentin表达上调，核转录因子ZEB2明显上调，而其他转录因子ZEB1、Snail和Twist2变化不明显。同时Transwell迁移实验发现，IGF-Ⅰ处理后的胃癌细胞迁移能力较对照组相比显著增强，其中MGC-803细胞，加药组与对照组相比，细胞平均迁移率自26±4.0％升高至78±1.5％; SGC-7901细胞平均迁移率自36±1.5％升高至79±8.5％(P＜0.05)。结果提示，IGF-Ⅰ能够诱导胃癌细胞发生EMT，增强胃癌细胞的迁移能力。　　2、IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT部分依赖于其下游的Akt和ERK信号通路　　100 ng/mL IGF-Ⅰ作用MGC803、SGC-7901和BGC-823细胞3分钟后，下游的IGF-ⅠR，Akt和ERK瞬时性活化增强，6小时后活化水平逐渐恢复至基线。IGF-ⅠR/ⅠR特异性抑制剂OSI-906(10μM)预处理2小时后，加入IGF-Ⅰ作用48小时，观察细胞形态并检测上皮和间质标志物水平变化。结果显示，与对照组相比，联合应用OSI和IGF-Ⅰ处理组的细胞形态呈紧密连接的上皮表型;E-cad下调和Vimentin、ZEB2上调水平逆转。在联合应用PI3K/Akt抑制剂LY294002(100μM)和IGF-Ⅰ，或ERK抑制剂PD98059（20μM）和IGF-Ⅰ后，EMT现象和ZEB2表达水平被部分逆转。同样，在应用siRNA瞬时敲除Akt或ERK后，IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT以及ZEB2上调被部分的逆转。这些结果提示，IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT部分依赖于其下游的Akt和ERK信号通路。　　3、Akt/ERK-miR-200c-ZEB2信号轴和Akt-GSK-3β-ZEB2信号通路可能参与了IGF-Ⅰ诱导胃癌细胞EMT　　100 ng/mL IGF-Ⅰ作用MGC803和SGC-7901细胞48小时后，核转录因子ZEB2显著上调，而ZEB2的mRNA水平并未发生改变。Real-time PCR检测发现在IGF-Ⅰ处理MGC803和SGC-7901细胞发生EMT后，microRNA-200c(miR-200c)的相对表达水平较对照组相比分别降低30％和50％，P＜0.05。此外，在IGF-Ⅰ作用前应用Akt抑制剂LY294002(100μM)或ERK抑制剂PD98059(20μM)预处理，miR-200c表达水平无明显改变。以上结果提示，在IGF-Ⅰ诱导胃癌细胞EMT的进程中可能存在着由Akt/ERK-miR-200c-ZEB2组成的信号轴的参与。另外，100ng/mL IGF-Ⅰ处理BGC-823细胞30分钟后，GSK-3β的Ser9位点显著活化，而当LY294002(100μM)预处理BGC-823细胞2小时后再加入100 ng/mL IGF-Ⅰ作用30分钟，GSK-3β的Ser9位点的活化被抑制。结果提示，PI3K/Akt信号通路的活化抑制GSK-3β的活性。而应用GSK-3β抑制剂AR-A01448(25μM)预处理2小时后再加入IGF-Ⅰ处理48小时，BGC-823细胞呈较为典型的间质化表型，Vimentin和ZEB2上调程度较对照组更为显著。以上结果提示，在IGF-Ⅰ诱导胃癌细胞EMT的过程中存在另一条Akt-GSK-3β-ZEB2通路，GSK-3β发挥维持胃癌细胞上皮表型的功能。　　4、Cbl-b抑制了IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT，维持了上皮细胞表型　　为探讨泛素连接酶Cbl-b在EMT中的作用，我们构建Cbl-b shRNA稳定转染胃癌MGC-803细胞系，G418压力筛选阳性克隆，Western blot验证，以未转染细胞系和转染对照质粒的细胞系作为对照，选取表达率为对照组10％以下的细胞株为阳性细胞株。倒置显微镜下观察发现，稳定敲除Cbl-b的胃癌细胞失去紧密连接的上皮结构，呈现EMT的特征。在IGF-Ⅰ处理后，稳转细胞系进一步向间质形态转化。同时，稳定敲除Cbl-b(ShRNA Cbl-b)组在加入IGF-Ⅰ处理后，E-cad下调、Vimentin和ZEB2上调水平进一步增强。Transwell实验同样显示，稳定敲除Cbl-b的ShRNACbl-b细胞迁移能力较对照组增强;当加入IGF-Ⅰ作用后，ShRNA Cbl-b组的细胞迁移能力进一步增强。上述结果提示，Cbl-b抑制了IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT，维持了上皮细胞的表型。　　5、Cbl-b负调控Akt/ERK-miR-200c-ZEB2轴，抑制IGF-Ⅰ诱导胃癌细胞EMT　　100 ng/mL IGF-Ⅰ短时间分别作用于沉默Cbl-b基因的胃癌细胞(ShRNA Cbl-b)及对照组细胞(NS Control)，其下游Akt和ERK信号通路活化时间较对照组显著延长。同时，基因芯片和Real-Time PCR发现，ShRNA Cbl-b组细胞miR-200c的表达较对照组相比分别降低50％和70％，P＜0.05。研究提示Cbl-b可能是通过抑制Akt/ERK-miR-200c-ZEB2轴，从而抑制了IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT。　　6、Cbl-b通过泛素化降解IGF-ⅠR，抑制IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT　　100 ng/mL IGF-Ⅰ作用MGC-803、SGC-7901和BGC-823细胞48小时后，IGF-ⅠR表达显著降低。为证实Cbl-b能否通过泛素化降解IGF-ⅠR，参与EMT的进程，MGC-803细胞首先经PS341(5nM)预处理12小时后，再用IGF-Ⅰ作用48小时，IGF-ⅠR的降解水平被明显抑制。免疫共沉降实验显示，当IGF-Ⅰ作用MGC-803细胞1小时后，Cbl-b与IGF-ⅠR共结合，6小时IGF-ⅠR发生泛素化降解，12小时泛素化降解最为明显。而与对照组相比，稳定敲除Cbl-b的MGC-803细胞在IGF-Ⅰ作用后IGF-ⅠR泛素化降解并不明显。以上结果提示Cbl-b可能是通过泛素化降解IGF-ⅠR，抑制IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT。　　7、胃癌患者组织中Cbl-b与IGF-ⅠR表达的相关性及与淋巴结转移风险的分析　　选择100例原发性胃腺癌患者组织标本，采用免疫组化方法检测Cbl-b与IGF-ⅠR的表达情况。结果显示，100例入组的患者标本中，69％的患者IGF-ⅠR呈阳性表达，58％的患者Cbl-b呈阳性表达。Spearman等级相关分析表明Cbl-b的表达与IGF-ⅠR的表达呈显著负相关，r=-0.265，p＜0.05。二者的表达率与临床病理特征的相关性分析结果显示，有淋巴结转移的病例中，IGF-ⅠR的表达显著高于无淋巴结转移的病例(p＜0.05); Cbl-b的表达显著低于无淋巴结转移的病例(p＜0.05)。在临床分期Ⅲ-Ⅳ期的病例中，IGF-ⅠR的表达显著高于Ⅰ-Ⅱ期的病例(p＜0.05);Cbl-b的表达显著低于Ⅰ-Ⅱ期的病例(p＜0.05)。而二者的表达与年龄、性别和Lauren分型无相关性。　　结论：　　1、IGF-Ⅰ能够诱导胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和BGC-823细胞EMT。　　2、IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT部分依赖于IGF-ⅠR下游Akt和ERK信号通路。　　3、由Akt/ERK-miR-200c-ZEB2组成的信号轴和Akt-GSK-3β-ZEB2通路参与IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT。　　4、Cbl-b能够抑制Akt/ERK-miR-200c-ZEB2轴，负向调控IGF-Ⅰ诱导的胃癌细胞EMT。　　5、Cbl-b能够泛素化降解IGF-ⅠR，抑制IGF-Ⅰ诱导的EMT，维持胃癌细胞的上皮表型。　　6、Cbl-b与IGF-ⅠR在胃癌组织标本中的表达呈显著负相关，更多IGF-ⅠR阳性表达和Cbl-b阴性表达的患者存在淋巴结转移风险。