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目的:Ang1-7对HUVECs内皮细胞抗衰老作用是否通过线粒体裂变途径,并进一步探讨其是否通过p53/Drp1轴介导起作用。方法:1 HUVECs内皮细胞培养、传代、种板,6孔板中细胞密度达80%以上时,根据实验方案加入AngⅡ建立内皮细胞衰老模型;2实验分组:经过前期大量预实验及查阅文献,确定AngⅡ、Ang1-7最适浓度均为1μmol/L,具体分组情况如下:第一部分:检测Ang1-7是否可减轻AngⅡ诱导的内皮细胞衰老(1)Control组;(2)Ang1-7组:1μmol/L的Ang1-7的完全培养液作用细胞48h;(3)AngⅡ组:1μmol/L的AngⅡ的完全培养液作用细胞48h;(4)AngⅡ+Ang1-7组:先用1μmol/L Ang1-7干预30分钟,然后加入含有1μmol/L Ang II完全培养基培养48h。检查各组衰老情况:观察并计数各组中SA-β-Gal阳性细胞,线粒体活性氧试剂盒检测细胞内总ROS的水平,Western blotting检测衰老蛋白(p53、Drp1)的表达量。第二部分:检测Ang1-7是否是通过p53/Drp1轴引起细胞内ROS增多,导致内皮细胞衰老(1)Control组;(2)AngⅡ组:1μmol/L的AngⅡ的完全培养液作用细胞48h;(3)AngⅡ+Ang1-7组:先用1μmol/L Ang1-7干预30分钟,然后加入含有1μmol/L Ang II完全培养基培养48h;(4)Drp1抑制剂组(AngⅡ+Mdivi-1):先用不同浓度的Mdivi-1(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)干预30分钟,再加入1μmol/L的AngⅡ的完全培养液作用细胞48h。首先检测不同浓度的Mdivi-1干预后Drp1的表达量,评估Mdivi-1对内皮细胞中Drp1的抑制效果,确定后续实验的Mdivi-1浓度;然后观察各组细胞的衰老情况:线粒体活性氧试剂盒检测细胞内总ROS的水平,Western blotting检测衰老蛋白(p53、Drp1)的表达量。结果:1评估Ang1-7对内皮细胞衰老的影响:(1)与Control组相比,AngⅡ处理组SA-β-Gal阳性细胞明显增多,细胞ROS水平、p53及Drp1蛋白相对表达量明显增加(P<0.001);(2)与AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang1-7组SA-β-Gal阳性细胞率降低(P<0.01),细胞ROS水平、p53及Drp1蛋白相对表达量降低(P<0.001);(3)与Control组相比,Ang1-7组SA-β-Gal阳性细胞的数量、ROS水平、p53及Drp1蛋白表达量均无明显差异(P>0.05)。2检测p53/Drp1轴是否能介导内皮细胞衰老:(1)不同浓度的Mdivi-1干预后Drp1的表达量的改变:与Control组相比,1μmol/L Mdivi-1组的Drp1蛋白的相对表达量差异无明显统计学意义(P>0.05),5、10μmol/L Mdivi-1组的Drp1蛋白的相对表达量明显降低(P<0.01);与1μmol/L Mdivi-1组相比,5、10μmol/L Mdivi-1组的Drp1表达量降低(P<0.05)。根据Mdivi-1说明,在1-10μmol/L浓度范围内,且随着Mdivi-1浓度的增加,Drp1蛋白的相对表达量降低呈递减性的,故Mdivi-1浓度取5μmol/L用于后续实验。(2)检测Mdivi-1对AngⅡ诱导细胞衰老过程中各组细胞ROS水平的影响:结合图像及上述实验结果分析:与Control组相比,AngⅡ处理组ROS明显增多,Mdivi-1组ROS减少;AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang1-7组、Mdivi-1组ROS水平明显降低。(3)WB检测蛋白Drp1的表达量分析:AngⅡ处理组相较于Control组,Drp1蛋白相对表达量明显增多,Mdivi-1组Drp1蛋白相对表达量减少;AngⅡ组相比,AngⅡ+Ang1-7组Drp1蛋白相对表达量减少,Mdivi-1组明显减少。结论:1 Ang1-7可减轻AngⅡ诱导的HUVECs衰老;2 AngⅡ诱导HUVECs衰老时,Ang1-7可通过p53/Drp1轴从而影响线粒体裂变途径,降低细胞内ROS,减轻内皮细胞的氧化应激水平而抗衰老。