人脐带华通氏胶干细胞培养基及其来源的外泌体对瘢痕疙瘩作用机制研究

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目的:瘢痕疙瘩是病理性瘢痕中最严重的一种类型,以成纤维细胞的异常增殖及细胞外基质过度沉积为特征。其形成机制不明,临床上治疗效果不佳,所以探究新的治疗策略具有重要意义。间充质干细胞的免疫调节、抗炎、抗纤维化作用为瘢痕治疗提供了新的启示。其中人脐带华通氏胶干细胞对瘢痕疙瘩的作用仍不明确,需要进一步验证。在本研究中,我们将探讨人脐带华通氏胶干细胞培养基及其来源的外泌体对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的影响,并探究其相关机制。方法:在临床上获取瘢痕疙瘩组织,通过组织块法提取人瘢痕疙瘩成纤维细胞;流式细胞仪检测间充质干细胞表面标记物CD44、CD73、CD90及CD105,及造血干细胞表面标记物CD34、CD45及HLA-DR的表达;油红O染色检测其成脂能力,茜素红S染色检测成骨能力,阿利辛蓝染色及番红O染色检测成软骨能力;收集第3-8代培养脐带华通氏胶干细胞的培养液,通过超速离心法提取外泌体,利用电镜、纳米粒径分析(NTA)、western blot验证提取的外泌体;将条件培养基与外泌体作用于人瘢痕疙瘩成纤维细胞,通过CCK-8法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性,划痕实验测瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移能力,通过western blot检测TGF-β、α-SMA及coll蛋白含量的表达;使用GraphPad Prism 6及Image J进行作图及统计分析。结果:瘢痕疙瘩组织块培养7-10天可见组织周围有零散的细胞爬出,培养14天左右可见大量长梭形细胞,聚集在组织块周围,逐渐向外围生长,培养20-25天时细胞间的融合度在70%左右进行传代。瘢痕疙瘩成纤维细胞边界明显,呈贴壁的梭形或三角形,细胞密度较大时呈漩涡状及鱼群状。人脐带华通氏胶干细胞呈贴壁培养状态,表现为长梭形或纺锤形,流式细胞仪检测高表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD73、CD90及CD105,而不表达造血干细胞表面标记物CD34、CD45及HLA-DR,且具备良好的成骨、成脂、成软骨能力;干细胞提取的外泌体粒径在116nm,占全粒径的99.3%,符合常规外泌体粒径范围30-150nm,电镜显示外泌体在负染视野下为清晰的囊泡轮廓,western blot检测出其特异性标志物CD63、ALIX、TSG101表达;CCK-8显示人脐带华通氏胶干细胞培养基及其来源的外泌体抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的活性;划痕实验证明人脐带华通氏胶干细胞培养基减弱瘢痕疙瘩成纤维细胞的迁移性,而其来源的外泌体增强了成纤维细胞的迁移性(p<0.05);人脐带华通氏胶干细胞培养基减弱了 TGF-β、α-SMA、coll蛋白的表达,而其来源的外泌体增强了这三种分子的表达,这种差异具有统计学意义(p<0.05)。结论:人脐带华通氏胶干细胞培养基可以抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长,但其来源的外泌体却有促进作用,推测人脐带华通氏胶干细胞培养基对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用可能是通过除外泌体以外的其他成分来实现的。该领域的进一步研究可能为瘢痕疙瘩的治疗开辟一条新途径。
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