目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病(diabetesmellitus，DM)常见而严重的并发症，是导致终末期肾衰竭的主要原因，因此探索DN的发病机制和防治策略是广大肾脏病学者热切关注的课题。gremlin是半胱氨酸结超家族的成员之一，是骨形态发生蛋白(BMP)2/4/7内源性拮抗剂，近年研究显示gremlin与糖尿病肾病的发生发展可能有密切关系，值得进一步研究探讨，为糖尿病肾病的防治寻找新的干预途径。　　 近来研究发现进展性糖尿病肾病患者肾活检标本gremlin mRNA和蛋白表达明显上调，尤其是小管间质纤维化区域，并同转化生长因子-β1(TGF-β1)分布相同。1型糖尿病STZ小鼠模型敲除grem1基因(grem1+/-)能抑制糖尿病肾病进展。抑制gremlin表达和维持BMP-7活性对糖尿病肾病具有保护作用。以上实验数据也表明gremlin参与了糖尿病肾病发病。我们课题组前期研究已发现体外高糖环境下小鼠系膜细胞胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase ERK1/2)通路被激活。ERK通路调控许多转录因子，控制细胞生长和细胞外基质聚集。高糖培养下的牛视网膜外膜细胞体外实验和STZ诱导的糖尿病小鼠模型的视网膜体内实验均表明高糖环境下激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase MAPK)，并且MAPK可影响gremlin基因表达。因而，ERK激活可能是高糖导致肾小球损伤的重要因素。有研究证实，吡格列酮可通过PPAR-γ通路抑制小鼠肾小球系膜细胞AP-1和TGF-β1及其下游fibronectin合成，还可抑制高糖环境下系膜细胞DAG-PKC-ERK旁路的激活可能在延缓DN发生发展方面有一定的干预作用。　　 目前有关gremlin在糖尿病肾病中的作用研究尚少。我们课题组前期研究已证实，gremlin可促进体外高糖环境下小鼠系膜细胞增生及细胞外基质(extracellular matrix EMC)合成聚集，然而，gremlin和TGF-β1、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor CTGF)之间具体复杂的相互作用机制，gremlin是否通过ERK1/2信号传导通路参与糖尿病肾病发病以及吡格列酮对gremlin是否有干预作用，尚未见报道。　　 本实验拟通过体外实验，采用基因转染(gene transfection)，RNA干扰(RNA interference)和吡格列酮药物干预方法，分子生物学检测手段，对体外高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞gremlin基因的表达进行干预，观察高糖环境中gremlin过表达和抑制状态下肾小球系膜细胞中gremlin、pErk1/2、TGF-β1、CTGF、Ⅳ型胶原表达的变化及高糖环境下gremlin基因在EMC代谢中的作用，为进一步揭示糖尿病肾病发病的分子学机制及寻找早期防治方法提供实验性理论依据。　　 方法:　　 1、Gremlin基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节激酶表达的影响。　　 1)小鼠系膜细胞的培养及质粒瞬时转染；　　 小鼠肾小球系膜细胞生长条件DMEM/F12(Gibco)含有10％FBS，Penicillin(100u/ml),Streptomycin(100ug/ml),37℃,5％CO2-95％air。六孔板，每孔细胞数2x106，或不加抗生素，培养24小时。用Lipofectanine2000 reagent(Invitrogen)转染pEGFP-N1和pEGFP-N1-Grem1质粒。脂质体2000瞬时转染方法严格按照LipofectamineTM2000说明书方法进行。质粒转染24小时后，细胞进一步在DMEM/F12高糖培养基(HG;30 mM)或正常糖培养基(NG;5.5 mM)环境下继续培养24小时。提取六孔板培养细胞蛋白及RNA。　　 2)小鼠系膜细胞分组及相关指标的检测；　　 小鼠肾小球系膜细胞分成4个实验组，即正常对照组(NG组，非转染的系膜细胞，D-葡萄糖5.5mmol/l)、高糖组(HG组，非转染的系膜细胞，D-葡萄糖30mmol/l)、高糖+空质粒组(HG+Ⅴ组，脂质体2000转染pEGFP-N1质粒，D-葡萄糖30mmol/l)、高糖+质粒转染组(HG+P组，脂质体2000转染pEGFP-N1-Grem1质粒，D-葡萄糖30mmol/l)。按分组情况给予高糖刺激，以开始给予高糖刺激定为“0”时，计算各组刺激时间。于24 h末收集细胞，免疫细胞化学检测PCNA蛋白的表达，Westernblot检测gremlin、pErk1/2、TGF-β1和CTGF蛋白的表达，实时定量PCR（RT-PCR）检测gremlin mRNA的表达，及放射免疫法(RIA)测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度（结果用总蛋白校正）。　　 2、Gremlin shRNA基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节激酶表达的影响。　　 1)小鼠系膜细胞的培养及质粒转染；　　 小鼠肾小球系膜细胞生长条件DMEM/F12(Gibco)含有10％FBS，Penicillin(100u/ml), Streptomycin(100ug/ml),37C,5％CO2-95％air。六孔板，每孔细胞数2x106，或不加抗生素，培养24小时。用Lipofectanine2000 reagent(Invitrogen)转染pGenesil1.1和pGenesil1.1-shGrem1质粒。脂质体2000瞬时转染方法严格按照LipofeetamineTM2000说明书方法进行。质粒转染24小时后，细胞进一步在DMEM/F12高糖培养基(HG;30mM)或正常糖培养基(NG;5.5 mM)环境下继续培养24小时。提取六孔板培养细胞蛋白及RNA。　　 2)小鼠系膜细胞分组及相关指标的检测；　　 小鼠肾小球系膜细胞分成4个实验组，即正常对照组（NG组，非转染的系膜细胞，D-葡萄糖5.5mmol/l）、高糖组(HG组，非转染的系膜细胞，D-葡萄糖30mmol/l)、高糖+空质粒组（HG+Ⅴ组，脂质体2000转染pGenesil1.1质粒，D-葡萄糖30mmol/l）、高糖+shRNA基因转染组(HG+SH组，脂质体2000转染pGenesil1.1-shGrem1质粒，D-葡萄糖30mmol/l)。按分组情况给予高糖刺激，以开始给予高糖刺激定为“0”时，计算各组刺激时间。于24 h末收集细胞，免疫细胞化学检测PCNA蛋白的表达，Western blot检测gremlin、pErk1/2、TGF-β1和CTGF蛋白的表达，实时定量PCR(RT-PCR)检测gremlin mRNA的表达，及放射免疫法(RIA)测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度（结果用总蛋白校正）。　　 3、吡格列酮对高糖环境下系膜细胞gremlin表达的影响。　　 将小鼠肾小球系膜细胞分为4组:正常对照组(A组，D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖组（B组，D-葡萄糖30mmol/L）、高糖+吡格列酮组(C组，吡格列酮:10μmol/L)、高糖+PD98059组(D组，PD98059∶20μmol/L)，刺激24小时后，免疫细胞化学检测PCNA蛋白的表达，Western blot检测gremlin、pErk1/2、TGF-β1和CTGF蛋白的表达，实时定量PCR(RT-PCR)检测gremlin mRNA的表达，及放射免疫法(RIA)测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度（结果用总蛋白校正）。　　 结果:　　 1、Gremlin基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节激酶表达的影响。　　 ①免疫细胞化学结果:正常对照组PCNA蛋白在小鼠系膜细胞的细胞核内有基础量的表达，高糖刺激后，表达信号呈强阳性，阳性细胞所占比例也明显的增加，高糖+pEGFP-N1质粒组较高糖组无明显变化，高糖+pEGFP-N1-Grem1质粒转染组较高糖组表达进一步增高，说明转染pEGFP-N1-Greml质粒进一步促进高糖刺激导致的小鼠系膜细胞的增殖;②Western blot结果:高糖刺激组gremlin、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表达较正常对照组增高，高糖+pEGFP-N1质粒组较高糖组无明显变化，高糖+pEGFP-N1-Grem1质粒转染组这四者表达较高糖组进一步升高;③RT-PCR结果:高糖刺激组gremlin mRNA水平表达较正常对照组增高，趋势与Western blot结果大致相同，高糖+pEGFP-N1质粒组较高糖组无明显变化，高糖+pEGFP-N1-Grem1质粒转染组gremlin mRNA表达较高糖组进一步升高;④放射免疫结果显示:与正常对照组相比，高糖组MMC上清液中Ⅳ型胶原浓度升高(P＜0.01);与高糖组相比，高糖+pEGFP-N1质粒组上述指标无明显变化（均P＞0.05）;高糖+pEGFP-N1-Grem1质粒组MMC上清液中Ⅳ型胶原浓度较高糖组升高(P＜0.01)，说明转染pEGFP-N1-Grem1质粒进一步促进高糖刺激导致的Ⅳ型胶原聚集。　　 2、Gremlin shRNA基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节激酶表达的影响。　　 ①免疫细胞化学结果:正常对照组PCNA蛋白在小鼠系膜细胞的细胞核内有基础量的表达，高糖刺激后，表达信号呈强阳性，阳性细胞所占比例也明显的增加，高糖+pGenesil1.1质粒组较高糖组无明显变化，高糖+pGenesil1.1-shGrem质粒转染组较高糖组表达明显降低，说明转染pGenesil1.1-shGrem质粒抑制了高糖刺激导致的小鼠系膜细胞增殖;②Western blot结果:高糖刺激组gremlin、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表达较正常对照组增高，高糖+pGenesil1.1质粒组较高糖组无明显变化，高糖+pGenesil1.1-shGrem质粒转染组较高糖组表达明显降低;③RT-PCR结果:高糖刺激组gremlin mRNA水平表达较正常对照组增高，趋势与Western blot结果大致相同，高糖+pGenesil1.1质粒组较高糖组无明显变化，高糖+pGenesil1.1-shGrem质粒转染组较高糖组表达明显降低。④放射免疫结果显示:与正常对照组相比，高糖组MMC上清液中Ⅳ型胶原浓度升高（P＜0.01）;与高糖组相比，高糖+pGenesil1.1质粒组上述指标无明显变化（均P＞0.05）;高糖+pGenesil1.1-shGrem质粒组MMC上清液中Ⅳ型胶原浓度较高糖组降低(P＜0.01)，说明pGenesil1.1-shGrem质粒转染促进了Ⅳ型胶原降解。　　 3、吡格列酮对高糖环境下系膜细胞gremlin表达的影响。　　 ①免疫细胞化学结果:正常对照组PCNA蛋白在小鼠系膜细胞的细胞核内有基础量的表达，高糖刺激后，表达信号呈强阳性，阳性细胞所占比例也明显的增加，高糖+吡格列酮组及高糖+PD98059组较高糖组表达明显降低，说明吡格列酮及PD98059抑制了高糖刺激所致的小鼠系膜细胞增殖;②Western blot结果:高糖刺激组gremlin、pERK1/2、TGF-β1、CTGF表达较正常对照组增高，高糖+吡格列酮组及高糖+PD98059组较高糖组表达明显降低;③RT-PCR结果:高糖刺激组gremlin mRNA水平表达较正常对照组增高，趋势与Western blot结果大致相同，高糖+吡格列酮组及高糖+PD98059组较高糖组表达明显降低;④放射免疫结果显示:高糖组MMC上清液中Ⅳ型胶原浓度较正常对照组升高(P＜0.01)，高糖+吡格列酮组(10μmol/L)和高糖+PD98059组（20μmol/L）组MMC上清液中Ⅳ型胶原浓度较高糖组降低（P＜0.01），说明吡格列酮及PD98059促进了Ⅳ型胶原的降解。　　 结论:　　 1、转染gremlin基因可促进高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞gremlin表达，促进gremlin表达后又可增加pERK1/2、TGF-β1、CTGF和Ⅳ型胶原表达，提示gremlin基因可能通过激活高糖环境下小鼠肾小球系膜细ERK1/2通路促进TGF-β1、CTGF表达及Ⅳ型胶原聚集，提示gremlin基因可能参与糖尿病肾病发生发展。　　 2、转染gremlin shRNA基因可抑制高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞gremlin表达，抑制gremlin表达后又可下调pERK1/2、TGF-β1、CTGF、Ⅳ型胶原表达，提示gremlin shRNA基因可能通过抑制高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞ERK1/2通路激活阻碍TGF-β1、CTGF表达及Ⅳ型胶原聚集，提示gremlin shRNA基因可能对糖尿病肾病有保护作用。　　 3、吡格列酮可抑制高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞中gremlin、pERK1/2、TGF-β1、CTGF以及Ⅳ型胶原表达，提示吡格列酮可能通过抑制高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞ERK通路激活阻碍gremlin、TGF-β1、CTGF表达及Ⅳ型胶原聚集，提示吡格列酮可能通过干预高糖环境下小鼠肾小球系膜细胞中gremlin表达延缓糖尿病肾病发生发展。