【摘 要】
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RNA干扰(RNA interfrence,RNAi)是一种短的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)引起的特异性抑制基因表达的转录后调控方式.用RNAi特异性下调目标基因表达是继反义与核酶技术之
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RNA干扰(RNA interfrence,RNAi)是一种短的双链RNA(double strand RNA,dsRNA)引起的特异性抑制基因表达的转录后调控方式.用RNAi特异性下调目标基因表达是继反义与核酶技术之后新兴的基因剔降(knock down)技术.目前RNAi应用的最大障碍是转导效率不高.病毒载体因其高效的转导效率成为介导RNAi的首选.最早成功用于介导RNAi的是逆转录病毒载体,慢病毒载体和腺病毒载体也有用于RNAi的不少报导.但是,逆转录病毒载体整合带来的风险,以及腺病毒载体的高免疫原性和移过性表达等问题,加快了开发介导高效RNAi的其它病毒载体的过程.重组腺病毒相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)具有安全性好、能感染多种类型细胞、可介导外源基因的长期表达等特点,是目前最理想的介导RNAi的病毒载体之一.但是,rAAV2载体介导RNAi的报导很少.本研究的目的是探索在哺乳动物细胞中,利用rAAV2病毒载体实现高效RNA干扰的策略.尝试用rAAV2病毒产生干扰性小RNA分子,以有效阻断目的基因表达.本文报道了一种携带人U6/H1-shRNA转录盒、高效、通用的rAAV2病毒载体的构建策略,组成该病毒载体的元件除包括Ⅲ型RNA聚合酶Ⅲ的人U6/H1启动子、目的基因发夹环的DNA序列和终止信号5T外,还包括位于人U6/H1-shRNA转录盒发夹环序列和病毒ITR之间作为间隔序列的增强性绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescence Protein,EGFP)表达盒,避免目的基因shRNA序列与ITR序列的相互影响,成功实现了rAAV2病毒载体介导的基因沉默.
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