流行病学调查显示,子痫前期(preeclampsia,PE)的发病率为5%～10%,并且呈现逐年上升的趋势。其主要临床表现为妊娠20周后出现的高血压和蛋白尿,严重时可引起孕母子痫、脑血管意外、视网膜剥离、急性肝肾功能不全、凝血功能障碍、多器官衰竭等,对新生儿早产、宫内生长受限、胎儿宫内窘迫、缺氧相关性神经损害、围产儿死亡等都影响巨大,是孕产妇病率和围生儿死亡率的主要原因之一。子痫前期不仅影响妊娠结局,而且影响孕产妇后续和子代远期慢性疾病的发生率,尤其可能增加心脑血管疾病、糖尿病、心脏病和代谢综合征等疾病的罹患风险。子痫前期的发生发展可能涉及母体、胎盘和胎儿等多种因素,包括有滋养细胞侵袭异常、免疫调节功能异常、内皮细胞损伤、遗传因素和营养因素等。但是目前没有任何一种单一因素能够解释所有子痫前期发病的病因和机制。新兴的表观遗传学尤其是DNA甲基化可能涉及该病的病理生理机制的多个环节,具有极大的研究潜力。本研究将针对胎盘组织的人类全基因组甲基化芯片结果,筛选差异性显著的候选基因加以验证,继而根据其在胎盘和外周血的表达情况,探讨其在子痫前期发病中的可能途径,并为外周血预测和监控标志物提供合理选择和理论基础。第一章 子痫前期胎盘组织甲基化情况及差异性甲基化候选基因生物学功能分析[目的]本课题采用病例对照研究,通过使用人类全基因组甲基化芯片检测早发型(EOPE)、晚发型(LOPE)子痫前期及对照组的胎盘组织DNA甲基化程度,按照特定条件筛选差异性显著的甲基化基因位点,分析其可能参与的生物学功能及信号通路,聚焦可能与母胎界面相关的若干基因位点,旨在进一步寻找参与子痫前期发生发展相关的候选基因以备后续验证。[方法]1、实验分组:选取年龄、产次及孕周相匹配的早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组孕妇各3例进行甲基化芯片检测。2、胎盘组织采集:分娩后30分钟内从胎盘中选取4个1cm3大小标本切成细条,用无菌PBS缓冲液清洗干净擦干,置于冻存管,-80℃冰箱保存。3、基因组DNA抽提及质控:用DNeasy Blood&Tissue Kit试剂盒抽提胎盘组织DNA,并进行质控使样品浓度不低于55ng/μl,样品总量不少于5μg。4、DNA甲基化基因芯片试验:对提取的胎盘组织DNA进行亚硫酸氢盐处理,芯片杂交、洗脱、延伸、成像。对甲基化芯片探针杂交和亚硫酸盐转换效率质控结果进行评价,原始数据采用Illumina公司的GenomeStudio软件进行数据处理分析。5、差异性甲基化基因定位及生物学功能聚类分析:利用Pubmed或GALAXY数据库识别差异甲基化位点在基因组中的位置;利用MEME数据库识别与CpG岛甲基化周围结合的基序;采用DAVID数据库对差异甲基化位点进行生物学功能聚类分析;Fischer’s exact test比较聚类分析后各信号通路的相对重要性。6、注释与免疫相关的差异性甲基化基因:采用Pubmed、Genecard和BioGPS对基因序列、具体描述、类型、染色体上所处位置、主要功能进行注释。[结果]1、甲基化芯片质控结果显示,探针符合质控标准,实验体系稳定。荧光信号强度强,均一;背景值低,亚硫酸盐转换效率高。2、甲基化芯片共检测胎盘组织中485,577个位点,EOPE组、LOPE组和对照组胎盘整体平均甲基化程度(β)为0.470、0.456和0.459,三组间差异无统计学意义(P>0.05)。3、早发型子痫前期与对照组、晚发型子痫前期和对照组胎盘对比共发现23308和18318个差异甲基化位点。同时满足差异有统计学意义及探针落在TSS或5’ UTR区域的位点分别为有999个和527个,交集有95个。4、子痫前期和正常分娩胎盘对比的差异性甲基化基因主要与以下生物学功能调控相关:多细胞生物过程、生长发育过程、多细胞生物发育过程、解剖结构发育、系统发育。5、与母胎界面免疫相关的基因位点在E-C组有17个,L-C组有6个,两者交集仅有两个位点,分别编码两个基因HLA-H和KIR2DL4。[结论]利用全基因组DNA甲基化芯片成功检测了子痫前期与正常分娩的胎盘组织,结果显示两者确实存在某些基因位点的甲基化状态改变。对芯片结果进行生物学信息分析发现,差异显著性基因涉及多条信息通路,主要和细胞生物过程、各系统及解剖结构发育相关。由于涉及的基因数量庞大,可选择某些位点进一步进行验证,为进一步研究子痫前期病理生理的变化规律,探讨有效诊治方法奠定基础。第二章与免疫相关的差异性甲基化候选基因选择及焦磷酸测序验证[目的]通过对子痫前期和正常胎盘组织甲基化概况的初步筛选,归类可能相关的生物学功能,聚焦合适的目标基因位点进行测序确定其甲基化程度的改变。采用焦磷酸测序技术,通过该技术验证筛选的差异性甲基化基因,比较早发型子痫前期、晚发型子痫前期和正常孕妇胎盘组织中该位点的甲基化差异,为后续该基因位点的蛋白表达及其与子痫发病的关联研究提供更多的证据。[方法]1、实验分组:选择2013年3月至2014年5月在福建省立医院产科分娩的46例孕妇,早发型子痫前期组16例,晚发型子痫前期组12例,正常足月分娩孕妇18例。2、确定焦磷酸测序目标基因:同时满足两个条件:甲基化差异矫正后有统计学意义(P<0.05,M>1.0或M<-1.0),限定探针分布在转录起始位点或5’UTR区域的位点。同时,该基因应为编码蛋白质的基因,在胎盘和外周血均有表达,且其基础甲基化水平较高。3、基因组DNA抽提及质控:用DNeasy Blood&Tissue Kit抽提基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度≥2ug。4、焦磷酸测序:设计引物,每个样本各取1～2μg用EpiTect Plus DNABisulfite Kit甲基化转化试剂盒进行转化。以转化后的DNA样本做模板进行PCR,取PCR产物在PyroMark Q24实时定量焦磷酸系列分析仪上进行测定。[结果]1、确定验证的目标基因:排除假基因,选择交集中两个基因之一 KIR2DL4。在早发型和对照组比较差异显著的基因中,由于TNFAIP8在胎盘和淋巴细胞上表达水平较高,且与维持细胞稳态和自身免疫调节功能密切相关,也予入选。2、三组年龄、孕次等无统计学差异,胎盘组织DNA质控评价合格。3、KIR2DL4两个位点的甲基化程度均较高,分别为50%及70%左右,但是三组间的差异均无统计学意义(P>0.05)。4、TNFAIP8两个位点的甲基化程度为10%左右。在TNFAIP8位点1中,早发型子痫前期组和其他两组相比甲基化程度的差异均有统计学意义(P<0.03);而晚发型子痫前期组和对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。三组间TNFAIP8位点2的甲基化程度差异无统计学意义(P>0.05)。[结论]选择待验证的基因位点除了要考虑基因类型、基础甲基化水平,还必须考虑该基因表达的器官及可能参与子痫前期发展的途径,否则会增加测序验证的风险,浪费不必要的经济资源。早发型子痫前期相对于晚发型子痫前期和正常分娩胎盘组织,TNFAIP8基因甲基化水平明显降低甚至未发生甲基化,而KIR2DL4基因的甲基化差异则无统计学差异。下一步我们将拓展对TNFAIP8基因在胎盘的表达定位、定量研究,以期从基因水平向分子层面进一步深化研究。第三章TNFAIP8在子痫前期及正常分娩胎盘组织表达情况的差异[目的]目前有关TNFAIP8蛋白在胎盘中表达情况以及在子痫前期发病中的作用,迄今尚未见相关报道。TNFAIP8的表达方式对于研究滋养细胞侵袭构建重塑血管是至关重要的。本研究旨在探讨TNFAIP8因子在胎盘组织中的定位定量表达情况,及与该基因在前期甲基化情况的关联,有助于阐明子痫前期病理性损伤的机制。[方法]1、实验分组:选择2013年3月至2014年8月在福建省立医院产科分娩的64例孕妇,早发型子痫前期组23例,晚发型子痫前期组16例,正常足月分娩孕妇25例。2、胎盘组织采集:分娩后30分钟内从胎盘中选取4个1cm3大小标本切成细条,用无菌PBS缓冲液清洗干净擦干,置于冻存管,-80℃冰箱保存。3、胎盘组织免疫组化:取尽可能新鲜0.5cm×0.5cm×O.1cm胎盘组织块,PBS冲洗后用4%多聚甲醛固定。包埋组织块、切片、脱蜡、入水、加入抗体、染色。选择实验组和对照组的阳性和阴性组织相、进行100×和400X的显微照相,分析图像。4、胎盘组织荧光定量RT-PCR:设计待检测的目的基因引物,用RNA提取试剂盒提取胎盘组织总RNA。用琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA的完整性。对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理,进行反转录后上荧光定量PCR仪,进行数据的相对定量分析。5、胎盘组织Western Blot:提取胎盘组织总蛋白、测定各组织样本蛋白含量。制备SDS-PAGE胶,蛋白样品变性、电泳。将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上,然后分别用一抗及二抗对其进行孵育、检测。洗膜、曝光及洗片,用image J软件分析灰度值。[结果]1、胎盘免疫组化结果:胎盘绒毛结构外围的合体滋养层细胞,绒毛内部血管内皮细胞TNFAIP8表达阳性。早发型子痫前期在阳性细胞数、阳性细胞显色强度及IHS评分方面,与晚发型子痫前期和正常胎盘组织相比明显增加。2、胎盘组织荧光定量RT-PCR结果:评估各标准曲线的线性相光度、扩增效率很高,可采用此种方法和上述引物进行后续样本的扩增分析。扩增曲线和溶解曲线显示目的基因和内参基因的扩增效率一致,扩增产物单一。三组间胎盘TNFAIP8mRNA相对表达量差异,两两相比均有统计学差异(P=0.000),早发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较晚发型子痫前期及对照组增多,晚发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较对照组增多(P=0.000)。3、胎盘组织Western Blot结果:三组TNFAIP8电泳条带显色按照早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组顺序逐渐递减。三组胎盘TNFAIP8蛋白表达量差异两两相比均有统计学差异(P=0.000),早发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较晚发型子痫前期及对照组增多(P=0.000),晚发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较对照组增多(P=0.000)。[结论]根据前期胎盘组织甲基化芯片和焦磷酸测序的验证结果,TNFAIP8基因明显低甲基化甚至未甲基化,按照一般规律TNFAIP8的转录及表达应该明显增高。本章验证了该推测,在胎盘组织中,早发型子痫前期的TNFAIP8表达明显高于晚发型子痫前期及正常孕妇,而晚发型子痫前期的TNFAIP8表达也明显高于正常孕妇。因此推测早发型子痫前期和晚发型子痫前期的TNFAIP8基因在胎盘有类似的甲基化和蛋白表达模式。第四章TNFAIP8在子痫前期和正常分娩孕妇外周血表达情况的差异[目的]以上研究发现,TNFAIP8基因在胎盘组织中明显低水平甲基化,高水平转录及表达,是可能参与子痫前期病因的重要影响因素。目前已经有文献证实TNFAIP8在淋巴组织表达,但是仅报道在胸腺、骨髓等淋巴组织中。TNFAIP8是否在外周血淋巴细胞表达,以及其表达是否能反映胎盘发生的病理改变,该规律尚无人研究。本章拟通过观察外周血淋巴细胞TNFAIP8的表达变化规律,探讨TNFAIP8作为血液标志物的可行性。[方法]1、实验分组:选择2013年3月至2014年8月在福建省立医院产科分娩的64例孕妇,早发型子痫前期组23例,晚发型子痫前期组16例,正常足月分娩孕妇25例。2、外周血采集:子痫前期孕妇及正常足月妊娠孕妇入院后抽取肘静脉血液3ml×2管,置于EDTA抗凝管中,-80℃冰箱保存。3、外周血荧光定量RT-PCR:实验步骤同第三章。4、外周血淋巴细胞蛋白Western Blot:提取外周血液淋巴细胞总蛋白,加入裂解液用枪吹打数下,使裂解液充分接触细胞将细胞裂解。悬浮细胞,收集培养细胞,裂解物经离心3～5分钟,取上清,即可进行后续实验。其余实验步骤同第三章。[结果]1、外周血荧光定量RT-PCR结果:实时扩增及产物溶解曲线图显示目的基因和内参基因的扩增效率一致,扩增产物单一。三组间外周血淋巴细胞TNFAIP8mRNA相对表达量差异两两相比均有统计学意义(P=0.000),早发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较晚发型子痫前期及对照组增多有统计学意义(P=0.000),晚发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较对照组增多有统计学意义(P=0.000)。2、外周血淋巴细胞蛋白Western Blot结果:三组外周血TNFAIP8电泳条带显色按照早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组顺序逐渐递减。三组胎盘TNFAIP8蛋白表达量差异两两相比均有统计学差异(P=0.000)。早发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较晚发型子痫前期及对照组增多有统计学意义(P=0.000),晚发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较对照组增多有统计学意义(P=0.000)。[结论]外周血淋巴细胞TNFAIP8的表达情况与胎盘组织相似,早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组三组的TNFAIP8转录和蛋白表达量按照该顺序递减且两两比较差异显著。对外周血的深入探索研究有望为子痫前期临床早期诊断预测、判断病情的严重程度提供理论依据。全文小结1.成功应用了人类全基因组DNA甲基化芯片(Illumina HumanMethylation450 BeadChip)分析了早发型子痫前期、晚发型子痫前期及正常分娩孕妇的胎盘组织甲基化情况。2.早发型子痫前期、晚发型子痫前期和正常胎盘组织,三组相比整体平均甲基化程度差异无统计学意义。3.与对照组相比,早发型子痫前期和晚发型子痫前期分娩的胎盘组织中存在甲基化差异表达基因,这些基因涉及细胞的发育与增值,主要参与的生物学功能包括:多细胞生物过程、生长发育过程、多细胞生物发育过程、解剖结构发育和系统发育等。这些基因具有巨大的研究潜力。4.对于甲基化芯片初筛的差异性甲基化基因,可以根据基因类型、基础甲基化水平,下一步研究的基因表达器官以及准备探讨的参与子痫前期发展的途径,来选择验证的目标基因,否则会增加测序验证的风险,浪费不必要的经济资源。5.早发型子痫前期相对于晚发型子痫前期和正常分娩胎盘组织,TNFAIP8基因甲基化水平明显降低甚至未发生甲基化。TNFAIP8因子主要定位表达在胎盘绒毛结构的合体滋养细胞和血管内皮细胞上,可能与滋养细胞侵袭、血管内皮细胞功能有关。子痫前期和正常胎盘组织相比,TNFAIP8转录和翻译均呈高水平表达,且其表达水平早发型明显高于晚发型,推测其可能参与子痫前期的发生发展。6.正常分娩胎盘TNFAIP8呈低水平表达但不是完全不表达,可能与维持正常胎盘组织免疫内环境的稳态相关。7.KIR2DL4的两个位点经焦磷酸测序验证均无统计学意义,该位点可能通过非DNA甲基化改变的机制或途径来参与子痫前期的发病,或是需要增加样本数量进一步研究。8.子痫前期和正常孕妇相比,外周血淋巴细胞高水平表达TNFAIP8,且早发型比晚发型子痫前期表达水平显著升高,有望作为子痫前期早期临床预测和追踪病情进展的血液指标。