微孢子虫是一种寄生于细胞内的机会性病原,宿主广泛,可通过食物和水进行传播,并引发微孢子虫病。微孢子虫具有独特的侵染装置——极管。极管从孢子弹出的过程称为发芽,在孢子发芽前,极管在孢子内缠绕于孢原质的外周,在适当的外界环境刺激下,极管快速地弹出并刺穿细胞膜,将含有细胞核的侵染性孢原质注入到宿主细胞。尽管对于极管形态结构的描述和研究已经有100多年,但目前仍然缺乏对极管组成机制、细胞黏附和侵染机制的深刻认识。在对于微孢子虫的极管蛋白研究中发现某些极管蛋白具有O-甘露糖基化修饰,可能与宿主细胞表面的甘露糖结合受体互作,在侵染过程中起作用。关于极管蛋白的构成,目前的研究发现,极管至少含有5种蛋白,其中已经有三种蛋白被鉴定并报道。本论文中以前期研究得到的假定极管蛋白4(Eh PTP4)作为研究对象,聚焦该蛋白的鉴定、功能及其宿主细胞表面结合受体等科学问题,从海伦微孢子虫中得到的假定极管蛋白4的基因序列出发,对其进行了功能域以及糖基化修饰等序列信息的分析、重组蛋白的表达、单克隆抗体和多克隆抗体的制备以及免疫荧光电镜定位分析,并利用流式细胞实验等对Eh PTP4的细胞学功能进行了分析,利用免疫共沉淀的方法对其细胞受体蛋白进行了鉴定,最后对Eh PTP4与其受体蛋白的互作关系及其在微孢子虫侵染过程中的作用进行了分析。本论文的主要结果总结为以下四个方面:1.海伦微孢子虫Ehhptp4基因序列的生物信息学分析利用序列分析软件和在线网站对Ehhptp4的基因序列特征进行了分析发现,Ehhptp4序列中含有一个信号肽,信号肽区域的氨基酸疏水性较高;Ehhptp4序列内部存在一个几丁质结合基序,该结合基序中三个功能相关的氨基酸(半胱氨酸Cys、脯氨酸Pro以及甘氨酸Gly)之中,有两个氨基酸(Cys和Gly)在Eh HPTP4内具有保守性,表明Eh HPTP4可能具有几丁质结合功能,这是在微孢子虫极管蛋白中首次发现的具有潜在几丁质结合能力的极管蛋白。另外,Eh HPTP4的C端尾部还包含1个富含组氨酸的基序(Histidine-rich region,HRR),可能在细胞黏附的过程中起着重要的作用。同时,在Eh HPTP4中含有6个半胱氨酸,其中4个在多种微孢子虫PTP4蛋白序列中高度保守,推测其在PTP4与其它蛋白互作的过程中起作用。另外,糖基化以及磷酸化位点预测显示,Eh HPTP4存在不同程度的糖基化修饰和磷酸化修饰,表明该蛋白可能属于糖蛋白,在细胞黏附的过程中发挥功能。另外,亚细胞定位预测显示Eh HPTP4是分泌型蛋白。2.海伦微孢子虫Eh HPTP4的定位分析通过对Eh HPTP4进行原核蛋白表达以及纯化,制备了相应单克隆和多克隆抗体。免疫印迹实验结果表明,制备的抗体可以清晰地与原核表达的Eh HPTP4以及孢子总蛋白中的Eh HPTP4发生免疫反应;间接免疫荧光实验、免疫透射电镜实验以及光电联合显微镜技术分析发现,兔多克隆抗体可以将Eh HPTP4定位于极管的全域,表明Eh HPTP4为极管蛋白的新成员,将其命名为极管蛋白4(Eh PTP4)。而Eh PTP4单克隆抗体却只能标记弹出后极管的最前端,该结果表明,在极管蛋白合成以及极管组装的过程中,Eh PTP4在极管不同部位可能存在不同的蛋白构象,各自行使不同的功能。Eh PTP4特殊抗原表位暴露于极管最前端,可能在极管与宿主细胞互作等方面发挥重要功能。3.海伦微孢子虫EhPTP4的功能分析基于序列信息分析发现,Eh PTP4具有几丁质结合功能,通过真核表达获得Eh PTP4的重组蛋白,利用碱溶法提取了微孢子虫脱蛋白几丁质壳(DCSCs),并利用IFA实验等证明了重组Eh PTP4蛋白以及天然Eh PTP4蛋白具有几丁质结合功能,表明Eh PTP4对极管在孢子内的固定、或者与宿主细胞表面的糖蛋白结合有关。利用免疫印迹实验、非变性凝胶电泳实验以及免疫共沉淀实验等对Eh PTP4多克隆抗体和单克隆抗体的免疫原性进行分析,结果表明,虽然两种抗体具有不同的定位特征,但是它们均可识别孢子总蛋白中同一个蛋白,即Eh PTP4,表明两种抗体的免疫原性都来自于Eh PTP4上的抗原表位,而单克隆抗体不能识别形成复合体的Eh PTP4,表明极管在组装过程中有部分Eh PTP4在极管顶端以单体的形式存在,而在极管其它区域则以聚合体的形式存在,参与极管的组装过程。进一步,本研究利用ELISA、IFA以及FACS等方法对Eh PTP4的细胞结合功能进行了分析,结果表明Eh PTP4具有宿主细胞结合功能,可与宿主细胞表面的某些未知成分互作,暗示其可能在极管侵染宿主的过程中起着重要的作用。4.海伦微孢子虫Eh PTP4细胞受体的鉴定以及分析在微孢子虫侵染机制研究中,对其侵染相关的细胞受体的研究未见任何报道,处于空白状态。本研究在Eh PTP4具有细胞结合能力的基础上,首先通过免疫共沉淀结合蛋白组学分析的方法,对其细胞受体进行了筛查,发现位于细胞表面的膜蛋白转铁蛋白受体1(Transferrin receptor 1,Tf R-1)为其潜在的细胞受体之一。为了进一步证明这二者之间的互作关系,分别通过pull down实验、非变性凝胶电泳实验以及荧光共定位实验等,对Eh PTP4与Tf R-1的互作关系进行分析验证,结果证明了两者间具有相互作用,表明这两个蛋白在极管进入宿主细胞的过程中,能够借助彼此之间的相互作用促进微孢子虫入侵宿主细胞。为了进一步证明Eh PTP4和Tf R-1在微孢子虫侵染宿主过程中所起的作用,分别利用抗体封闭实验,将原核表达蛋白加入细胞的培养体系,以及从宿主细胞上敲除转铁蛋白受体等方法,证明了当Eh PTP4与Tf R-1之间的互作受到影响时,微孢子虫对宿主的侵染能力也会受到很大程度的抑制,进一步确认了Eh PTP4以及Tf R-1在微孢子虫侵染宿主过程中的重要性。另外,鉴于Tf R-1是通过受体蛋白介导的内吞作用将铁离子运输进入细胞,利用小分子抑制剂Pitstop 2对内吞作用进行抑制,发现同时抑制了微孢子虫对细胞的侵染,暗示微孢子虫极管顶端在接触到宿主细胞后,可能借助Eh PTP4和Tf R-1的互作,通过细胞内吞的作用进入细胞内部。综上所述,在本研究中,我们对海伦微孢子虫极管蛋白4(EhPTP4)进行了鉴定以及功能分析,并且首次发现了与微孢子虫侵染相关的细胞受体蛋白Tf R-1,并分析证明了Eh PTP4和Tf R-1之间具有互作关系,同时对这种互作关系在微孢子虫侵染宿主过程中的作用进行了研究,证明了海伦微孢子虫极管顶端是通过细胞内吞的作用进入宿主细胞以实现微孢子虫的入侵感染。本论文的研究结果为微孢子虫侵染机制的研究提供新的线索和思路,并为最终微孢子虫机制的阐明奠定了强有力的基础。