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研究目的：
角膜损伤是眼科急诊中最常见的病例之一，化学损伤占到所有角膜损伤的8%，而其中，碱烧伤导致的后果最为严重。目前角膜化学损伤的药物治疗方法主要包括各种滴眼液。但由于泪液以及眨眼的冲刷，都会使得这些滴眼液快速从角膜上清除，导致药物生物利用度极低。角质细胞生长因子（KGF）可以促进角膜上皮细胞增殖、迁移，抑制炎症，抑制新生血管生成，以及抑制瘢痕增生。但是由于KGF是蛋白类药物，在室温下非常不稳定，极易失活。水凝胶是一种类固体的机械性能和良好生物相容性的载体材料，适合包载生物活性生长因子。巯基化的水凝胶与生物组织界面具有生物粘附性，可以显著延长水凝胶在眼部的滞留时间。本课题针对角膜生理生化环境的特点，通过使用自主合成的巯基化γ聚谷氨酸（PGA-Cys）作为凝胶基质材料来，包载KGF，构建具有生物粘附性的KGF-PGA-Cys水凝胶，并从体外与体内系统地探讨了对角膜的生物粘附性并分析其在体内对角膜损伤模型的药理作用、制剂疗效及可能涉及的机制。
研究方法：
（1）通过EDC/NHS法，合成巯基化PGA（PGA-Cys）；通过傅立叶红外光谱仪（FT-IR）和核磁共振氢谱（1H-NMR）对PGA-Cys结构进行表征，检测Cys成功接枝在PGA上；通过Ellman’s assay法测定不同PGA和Cys投料比下的巯基接枝率。
（2）应用合成的PGA-Cys凝胶材料，制备PGA-Cys生物粘附型水凝胶，通过扫描电镜观察PGA-Cys水凝胶的微观形态；采用“倒立法”测定成胶时间；采用黏度计和流变仪观察其机械性能和表观黏度；通过搭接剪切实验研究其生物粘附力，并对比PGA和PGA-Cys包载的KGF的体外释放行为，同时对释放后KGF进行SDS-PAGE和圆二色光谱测定其稳定性。采用表面等离子共振（SPR）检测PGA-Cys和KGF相互作用力，并以肝素溶液作为阳性对照。综合以上实验，制备出符合角膜损伤治疗要求的生物粘附型KGF-PGA-Cys水凝胶制剂。
（3）通过体外培养小鼠成纤维细胞（NIH3T3），以MTT实验评价细胞存活率，考察不同浓度PGA-Cys水凝胶对3T3生物相容性。通过H2O2氧化损伤，建立体外损伤模型，考察不同KGF浓度对3T3促增殖效果；检测KGF-PGA-Cys水凝胶对3T3损伤模型的促增殖效果研究，从而评价KGF-PGA-Cys水凝胶体外细胞生物活性。
（4）构建SD大鼠角膜碱烧伤模型，通过FITC-KGF以及活体成像测定其药物在眼部滞留效果，评价其在体生物粘附性。同时，经原位滴入给药，将KGF-PGA-Cys水凝胶应用到大鼠角膜损伤部位。通过大鼠眼球外观、离体角膜、HE染色、Masson以及免疫组化等方法评价损伤角膜的修复情况，观察角膜上皮细胞增殖和凋亡、炎症、新生血管以及瘢痕生成情况。
研究结果：
（1）本实验制备的PGA-Cys水凝胶材料通过FT-IR和1H-NMR，证明巯基成功接枝到PGA上。同时，可以通过改变PGA和Cys的投料比，来获得不同巯基接枝的PGA-Cys。
（2）研究中以巯基交联构建了具有良好生物黏附力和缓控释放的PGA-Cys水凝胶。实验结果显示，PGA-Cys水凝胶微观呈现3D孔隙结构，适合包载KGF大分子药物。同时在一定范围内，随着PGA-Cys巯基接枝率以及浓度的增加，其成胶时间缩短，表观粘度升高，生物粘附性增加，但过高的巯基含量会降低其表观粘度。筛选出PGA-Cys巯基接枝率为1.5mmol/g PGA-Cys-1.5，浓度为4%时做为后期实验处方；该凝胶不仅具有良好的机械性能，还具有剪切稀化性能。同时在体外具有良好的生物粘附力；体外释放结果表明：PGA-Cys对KGF具有良好的缓控释能力，同时释放的KGF结构稳定。此外，PGA-Cys和KGF之间具有很强的相互作用力。
（3）体外实验证明，PGA-Cys水凝胶与3T3具有良好生物相容性。同时筛选出KGF最佳给药浓度为100μg/ml以及H2O2氧化损伤浓度100μM，建立稳定的3T3细胞H2O2损伤模型，该凝胶负载KGF对3T3细胞H2O2损伤模型具有良好的促增殖和保护作用，说明KGF-PGA-Cys水凝胶中释放的KGF具有良好的体外细胞生物活性。
（4）将最优配比的KGF生物粘附型水凝胶应用到大鼠角膜损伤模型中。PGA-Cys水凝胶在眼部具有良好的生物粘附性，可以延长滞留时间至360min。治疗7天后，在KGF-PGA-Cys组中角膜上皮层形态修复良好，无明显瘢痕增生，TNF-α以及TGF-β表达下降，可以抑制炎症反应和抑制纤维化。此外ki67表达上调，TUNEL荧光减弱，可以促进角膜上皮细胞增殖以及抑制角膜细胞凋亡，明显下调CD31、α-SMA和VEGF的表达，可以抑制新生血管生成。以上种种结果，都是KGF-PGA-Cys水凝胶的生物粘附和缓控释放性能共同作用的结果。
研究结论：
巯基化PGA-Cys水凝胶联合原位给药技术为KGF在角膜损伤局部应用打下制剂研究基础。PGA-Cys作为多肽聚合物，通过巯基形成二硫键相互交联，形成凝胶。同时多余的巯基会与角膜表面具有巯基的蛋白相反应，形成二硫键，从而达到生物粘附的作用。同时巯基对于KGF具有亲和性可以有效调节KGF的释放在这项研究中，KGF-PGA-Cys水凝胶包载KGF保护结构稳定性，释放的KGF具有良好的体外细胞活性，同时生物粘附性有效延长了受损角膜对KGF的吸收利用率，增强了KGF对角膜损伤的形态和功能修复作用。因此，巯基型KGF-PGA-Cys生物粘附水凝胶能作为实现KGF局部治疗的理想的药物递送载体。
角膜损伤是眼科急诊中最常见的病例之一，化学损伤占到所有角膜损伤的8%，而其中，碱烧伤导致的后果最为严重。目前角膜化学损伤的药物治疗方法主要包括各种滴眼液。但由于泪液以及眨眼的冲刷，都会使得这些滴眼液快速从角膜上清除，导致药物生物利用度极低。角质细胞生长因子（KGF）可以促进角膜上皮细胞增殖、迁移，抑制炎症，抑制新生血管生成，以及抑制瘢痕增生。但是由于KGF是蛋白类药物，在室温下非常不稳定，极易失活。水凝胶是一种类固体的机械性能和良好生物相容性的载体材料，适合包载生物活性生长因子。巯基化的水凝胶与生物组织界面具有生物粘附性，可以显著延长水凝胶在眼部的滞留时间。本课题针对角膜生理生化环境的特点，通过使用自主合成的巯基化γ聚谷氨酸（PGA-Cys）作为凝胶基质材料来，包载KGF，构建具有生物粘附性的KGF-PGA-Cys水凝胶，并从体外与体内系统地探讨了对角膜的生物粘附性并分析其在体内对角膜损伤模型的药理作用、制剂疗效及可能涉及的机制。
研究方法：
（1）通过EDC/NHS法，合成巯基化PGA（PGA-Cys）；通过傅立叶红外光谱仪（FT-IR）和核磁共振氢谱（1H-NMR）对PGA-Cys结构进行表征，检测Cys成功接枝在PGA上；通过Ellman’s assay法测定不同PGA和Cys投料比下的巯基接枝率。
（2）应用合成的PGA-Cys凝胶材料，制备PGA-Cys生物粘附型水凝胶，通过扫描电镜观察PGA-Cys水凝胶的微观形态；采用“倒立法”测定成胶时间；采用黏度计和流变仪观察其机械性能和表观黏度；通过搭接剪切实验研究其生物粘附力，并对比PGA和PGA-Cys包载的KGF的体外释放行为，同时对释放后KGF进行SDS-PAGE和圆二色光谱测定其稳定性。采用表面等离子共振（SPR）检测PGA-Cys和KGF相互作用力，并以肝素溶液作为阳性对照。综合以上实验，制备出符合角膜损伤治疗要求的生物粘附型KGF-PGA-Cys水凝胶制剂。
（3）通过体外培养小鼠成纤维细胞（NIH3T3），以MTT实验评价细胞存活率，考察不同浓度PGA-Cys水凝胶对3T3生物相容性。通过H2O2氧化损伤，建立体外损伤模型，考察不同KGF浓度对3T3促增殖效果；检测KGF-PGA-Cys水凝胶对3T3损伤模型的促增殖效果研究，从而评价KGF-PGA-Cys水凝胶体外细胞生物活性。
（4）构建SD大鼠角膜碱烧伤模型，通过FITC-KGF以及活体成像测定其药物在眼部滞留效果，评价其在体生物粘附性。同时，经原位滴入给药，将KGF-PGA-Cys水凝胶应用到大鼠角膜损伤部位。通过大鼠眼球外观、离体角膜、HE染色、Masson以及免疫组化等方法评价损伤角膜的修复情况，观察角膜上皮细胞增殖和凋亡、炎症、新生血管以及瘢痕生成情况。
研究结果：
（1）本实验制备的PGA-Cys水凝胶材料通过FT-IR和1H-NMR，证明巯基成功接枝到PGA上。同时，可以通过改变PGA和Cys的投料比，来获得不同巯基接枝的PGA-Cys。
（2）研究中以巯基交联构建了具有良好生物黏附力和缓控释放的PGA-Cys水凝胶。实验结果显示，PGA-Cys水凝胶微观呈现3D孔隙结构，适合包载KGF大分子药物。同时在一定范围内，随着PGA-Cys巯基接枝率以及浓度的增加，其成胶时间缩短，表观粘度升高，生物粘附性增加，但过高的巯基含量会降低其表观粘度。筛选出PGA-Cys巯基接枝率为1.5mmol/g PGA-Cys-1.5，浓度为4%时做为后期实验处方；该凝胶不仅具有良好的机械性能，还具有剪切稀化性能。同时在体外具有良好的生物粘附力；体外释放结果表明：PGA-Cys对KGF具有良好的缓控释能力，同时释放的KGF结构稳定。此外，PGA-Cys和KGF之间具有很强的相互作用力。
（3）体外实验证明，PGA-Cys水凝胶与3T3具有良好生物相容性。同时筛选出KGF最佳给药浓度为100μg/ml以及H2O2氧化损伤浓度100μM，建立稳定的3T3细胞H2O2损伤模型，该凝胶负载KGF对3T3细胞H2O2损伤模型具有良好的促增殖和保护作用，说明KGF-PGA-Cys水凝胶中释放的KGF具有良好的体外细胞生物活性。
（4）将最优配比的KGF生物粘附型水凝胶应用到大鼠角膜损伤模型中。PGA-Cys水凝胶在眼部具有良好的生物粘附性，可以延长滞留时间至360min。治疗7天后，在KGF-PGA-Cys组中角膜上皮层形态修复良好，无明显瘢痕增生，TNF-α以及TGF-β表达下降，可以抑制炎症反应和抑制纤维化。此外ki67表达上调，TUNEL荧光减弱，可以促进角膜上皮细胞增殖以及抑制角膜细胞凋亡，明显下调CD31、α-SMA和VEGF的表达，可以抑制新生血管生成。以上种种结果，都是KGF-PGA-Cys水凝胶的生物粘附和缓控释放性能共同作用的结果。
研究结论：
巯基化PGA-Cys水凝胶联合原位给药技术为KGF在角膜损伤局部应用打下制剂研究基础。PGA-Cys作为多肽聚合物，通过巯基形成二硫键相互交联，形成凝胶。同时多余的巯基会与角膜表面具有巯基的蛋白相反应，形成二硫键，从而达到生物粘附的作用。同时巯基对于KGF具有亲和性可以有效调节KGF的释放在这项研究中，KGF-PGA-Cys水凝胶包载KGF保护结构稳定性，释放的KGF具有良好的体外细胞活性，同时生物粘附性有效延长了受损角膜对KGF的吸收利用率，增强了KGF对角膜损伤的形态和功能修复作用。因此，巯基型KGF-PGA-Cys生物粘附水凝胶能作为实现KGF局部治疗的理想的药物递送载体。