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目的:调节性T细胞(Treg)是具有抑制免疫反应和免疫自稳功能的一类T细胞亚群,通过发挥免疫调节功能而防止自身免疫病的发生。Treg细胞保证其谱系特性的核心是持续的Foxp3蛋白表达和发挥免疫抑制功能。探索维持Treg谱系稳定性的调控网络,具有重要的理论价值和临床应用前景。研究发现Lkb1可通过控制T细胞发育及活化以维持机体免疫平衡,而对Lkb1在Treg中的功能机制研究仍是一片空白。我们的前期数据发现在TCR刺激下Treg胞内Lkb1蛋白水平上调,提示Lkb1可能在调控Treg免疫调节功能中发挥作用。本研究将探索Lkb1对Treg细胞生物学功能及免疫平衡的调控作用及其分子机制,为临床上免疫性疾病的治疗策略提供科学依据。方法:构建Treg特异性Lkb1敲除小鼠(Foxp3Cre-YFPLkb1f/f);观察野生型(Fop3Cre-YFP,WT)及Lkb1条件敲除(cKO)小鼠一般体征,分析淋巴器官和细胞特征、各器官病理及观察生存期;流式细胞术检测小鼠T细胞极化和活化情况,Treg比例、数量、凋亡水平、细胞周期分析及转录因子磷酸化水平;构建Foxp3CreAMPKa1/fAMPKa2f/f条件性敲除小鼠验证Treg中Lkb1缺失所致的小鼠表型是否由经典下游分子AMPK介导;分别构建Foxp3CreLkb1f/fRosa26YFP谱系示踪小鼠模型和WT,cKOTreg细胞竞争性过继回输模型检测Treg细胞Foxp3表达稳定性;构建ERT2CreLkb1ffRosa26YFP小鼠验证Lkb1瞬时敲除对Treg中Foxp3表达的影响,同时用Foxp3Cre/+Lkb1f/f无明显免疫活化的雌性小鼠(体内约1/2的Treg为Lkb1敲除型,剩余为野生型Treg)验证Lkb1缺失所致的Foxp3表达变化是否为内源性机制调控;分别在转录因子STAT5、6、3、4对应的上游细胞因子IL-2,IL-4,IL-6或IL-12刺激下,体外培养检测Treg中Foxp3表达变化;重亚硫酸盐处理检测Foxp3 CNS2区DNA甲基化水平;免疫共沉淀检测转录因子STAT4与甲基化转移酶DNMT1、DNMT3的结合情况;染色质免疫共沉淀实验检测转录因子STAT4、STAT5在Foxp3 CNS2区的结合情况。结果:Foxp3Cre-YFPLkb1f/f严小鼠出生后40天内死亡,并表现为脾脏和全身外周淋巴结明显肿大、各器官有大量炎症细胞浸润;Foxp3Cre-YFPLkb1f/f小鼠淋巴器官Treg比例明显低于野生型小鼠,CD4+、CD8+常规T细胞增殖、活化增加,并表现为向Th1、Th17分化增加;Foxp3CreLkb1f/fRosa26YFP小鼠淋巴器官中约有70%的Treg细胞不再表达Foxp3;Foxp3CreAMPKa1f/fAMPKa2f/f小鼠并未表现出Foxp3Cre-YFP-PLkb1f/f小鼠的上述T细胞表型;体外将Foxp3Cre-YFP/kb1f/ff中的Treg与树突状细胞(Dendriticcell,DC)共培养,在IL-2+IL-12刺激下可诱导Lkb1缺陷的Treg中Foxp3表达关闭,而野生型则能维持表达;Lkb1缺陷Treg中Foxp3的转录调控元件保守非编码区2(conserved noncoding sequence 2,CNS2)DNA甲基化水平相比野生型上调;Lkb1缺失的Treg中转录因子STAT4磷酸化水平升高;STAT4可与甲基化转移酶DNMT1结合,同时STAT4可与Foxp3的CNS2区结合,甲基化抑制剂可逆转Lkb1缺失Treg中的Foxp3表达及CNS2甲基化。结论:1.Treg中Lkb1缺失会导致小鼠致死性自身免疫病;2.Lkb1可维持Treg中Foxp3的表达和Foxp3 CNS2区的DNA去甲基化;3.Treg中Lkb1的功能并不依赖下游分子AMPK介导;4.Lkb1抑制Treg中STAT4活化及与Foxp3 CNS2区DNA结合;5.STAT4活化后可与DNMT1结合并促进Foxp3 CNS2区DNA甲基化。目的:机体免疫自稳的维持有赖于免疫激活与免疫抑制相互拮抗。稳态下,调节性T细胞(Treg)在各器官的比例保持在相对稳定的水平,既维持免疫系统的平衡,又能保证免疫系统快速有效激活。Treg细胞数量受胸腺发生、细胞增殖、凋亡和外周诱导产生等过程调控。在炎症环境下,Treg细胞数量会随T细胞免疫激活而相应增加,促进免疫耐受,从而防止过度炎症损伤。然而,这种稳态和炎症环境下调控Trg细胞数量的信号及分子机制仍未阐明。课题组前期数据发现在DC条件性敲除Lkb1的小鼠中观察到稳态下Treg细胞在各器官CD4+T细胞中的比例数量都显著升高,而不影响DC本身数量及主要表面标记。本研究将探索在炎症环境下DC中Lkb1对Treg细胞数量的调控机制。方法:构建小鼠LPS及E.coli腹膜炎模型;qPCR及western blot检测LPS腹膜炎及E coli腹腔感染模型小鼠脾脏DC中Lkb1 mRNA及蛋白水平变化;流式分析统计LPS腹膜炎及E.coli腹腔感染模型小鼠脾脏及淋巴结中Treg细胞绝对数及占CD4+T细胞的比例;流式分析LPS及E.coli模型小鼠中Treg细胞的来源和DC细胞表面OX40L表达水平;对照或LPS处理DC细胞与Treg细胞体外共培养,检测其对Treg细胞的促增殖能力,且是否由OX40L介导;构建野生型(Lkb1f/f,WT)、CD11c特异性Lkb1敲除小鼠(CD11cCreLkb1f/f,cKO)及在此基础上特异性清除Treg细胞小鼠(Lkb1f/fFoxp3DTR,WT-DTR 与 CD11ccreLkb1f/fFoxp3DTR,KO-DTR),及单核吞噬细胞特异性Lkb1敲除小鼠(LysMCreLkb1f/f);检测WT、条件敲除型(cKO)及特异性清除Treg细胞小鼠对致死剂量LPS及E.col/腹腔炎的耐受能力;检测小剂量LPS或E.col/预处理小鼠在特异性清除或不清除Treg细胞后对致死剂量LPS及E.coli腹腔炎的耐受能力;检测Lkb1敲除的DC与LPS处理DC的mRNA芯片数据并进行GSEA等分析,同时qPCR验证mRNA水平变化。结果:LPS及E.coli腹膜炎小鼠脾脏及淋巴结中Treg细胞数量及占CD4+T细胞比例都明显升高;流式分析LPS及E.coli模型中升高的Treg细胞中Nrp1及Helios表达水平显示均为胸腺来源的tTreg细胞;前期结果发现Lkb1缺失的DC可通过上调细胞表面OX40L表达,促进Trg细胞增殖,导致敲除小鼠体内多器官Treg细胞比例、数量增加;LPS腹膜炎小鼠脾脏DC中Lkb1 mRNA水平相比对照小鼠DC并无明显变化,但Lkb1蛋白水平相比对照组显著降低;这种Lkb1蛋白的诱导性降解仅在DC和巨噬细胞中被观察到,而在B细胞、T细胞和Trg细胞中未出现;LysMCreLkb1f/f小鼠中并未观察到Treg细胞比例升高表型;LPS处理的DC表面OX40L表达上调;体外与Treg细胞共培养,LPS处理的DC相比对照DC具有更强的促Treg细胞增殖能力,且可被OX40L中和抗体所阻断;在接受致死剂量LPS或E.coli腹腔注射后,cKO小鼠相比WT小鼠表现出对LPS或E coli更强的耐受能力,但在cKO小鼠中特异性清除Treg细胞后这种差异不显著;用小剂量LPS或E.coli预处理模拟Lkb1在DC中敲除,在特异性清除或不清除Treg细胞后,继续给予致死剂量LPS或E.coli刺激,其中特异性清除Treg细胞后的未预处理组小鼠生存期最短,LPS预处理组小鼠的生存期显著长于未处理组,而特异性清除预处理组小鼠中的Treg细胞后则差异不明显;然而在Ecoli预处理生存期实验中,尽管预处理组小鼠表现出最高的生存率,但是否清除Treg细胞对小鼠生存期并无明显影响;通过分析Lkb1敲除DC和LPS处理DC与对照DC的mRNA芯片中的差异基因,我们发现Lkb1缺陷DC与LPS处理DC中促Treg细胞增殖的Ox40l mRNA水平都显著上调,而GSEA分析显示在LPS组DC中富集的参与炎症反应和免疫效应过程的差异基因在Lkb1敲除DC中并无变化。结论:1.LPS和E.coli腹膜炎可诱导小鼠DC中Lkb1蛋白下降而促进tTreg细胞增加;2.Lkb1缺陷的DC可通过上调OX40L表达促进tTreg细胞增殖;3.DC特异性敲除Lkb1小鼠中增加的Treg细胞有助于小鼠耐受致死剂量的LPS及E.coli感染;4.LPS预处理升高的Treg细胞有助于小鼠耐受致死剂量的LPS负荷;5.Lkb1是LPS诱导的DC内促炎与抗炎程序的分界检测点。