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目的杜氏肌营养不良症（Ducherme muscular dystrophy,DMD）是一种以四肢近端骨骼肌进行性变性、坏死和小腿腓肠肌假性肥大为主要临床特征的致死性X-连锁隐性遗传病。该病由抗肌萎缩蛋白（dystrophin）发生结构和功能的改变所致。本病主要累及男性,发病率约占活产男婴的1/3500,女性为携带者,通常不发病。目前尚无有效的治疗方法。编码抗肌萎缩蛋白的dystrophin基因为DMD的致病基因,定位于Xp21.1,共有79个外显子,是迄今发现的人类最大的基因,这样大的基因易出现高频率的新突变和异位断裂点。目前研究表明dystrophin基因主要以缺失突变为主,占全部突变的55～65%,重复突变占5～10%左右,点突变和微小插入/缺失占30%左右,突变范围几乎累及所有的外显子。由于基因巨大突变类型多样,建立全面有效的DMD分子诊断方法有一定的挑战。目前主要采用多重PCR（multiplex polymerasechain reaction,mPCR）方法扩增致病基因的缺失热点区,已无法满足基因诊断和遗传咨询的需要。这就需要联合多种技术对致病基因进行全面快速的筛查。本研究采用的多重连接依赖式探针扩增（multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA）技术能够同时扩增40个靶基因位点,已经成为检测dystrophin基因组重排（缺失/重复）的一线筛查技术。同时采用的变性高效液相色谱（denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC）技术已在遗传病基因诊断中得到广泛应用,能够对未知的单核苷酸多态性（single nucleotidepolymorphism,SNP）和微小突变进行快速分析鉴定,可作为MLPA技术的有力补充。本课题联合运用MLPA和DHPLC技术对DMD患儿的dystrophin基因进行突变检测,旨在改善DMD的分子诊断策略,进一步扩大检测范围,并确定这种联合方法的准确性和有效性。材料与方法一、实验材料患儿44例,男性,年龄2～10岁,由中国医科大学附属二院儿科提供外周血样及相关病历资料。20例正常男性和50～100例正常女性作为本研究的正常对照。常规方法提取基因组DNA,采用覆盖dystrophin基因部分缺失热点区的12对引物对DMD患儿的DNA样本进行mPCR扩增,未发现大尺度缺失。MLPA DMD试剂盒（SALSA MLPA DMDP034/035 DMD/BMD）购自荷兰MRC-Holland公司。主要仪器有UNOⅡ48型PCR扩增仪（德国Biometra公司）,Beckman CEQ-8000遗传分析仪（美国Beckman公司）和WAVE?核酸片段分析系统（美国Transgenomic公司）。二、方法1、应用MLPA技术筛查dystrophin基因缺失/重复突变MLPA DMD试剂盒的两组多重探针P034和P035,分别针对dystrophin基因第1～79外显子的特定序列设计。50～500 ng DNA溶于5μl Tris-EDTA,95℃变性5 min。当温度迅速降到25℃时,加入探针混合物P034（或P035）,充分混匀后,95℃变性5min,60℃杂交过夜。杂交16h后,下降温度至54℃时加入连接酶Ligase-65,54℃连接15min后灭活Ligase-65（98℃,5min）。最后用SALSA FAMPCR引物对连接的探针进行PCR扩增。应用Beckman CEQ-8000遗传分析仪进行毛细管电泳分离、分析扩增产物,结果经Fragment Analysis软件分析和MicrosoftExcel模板处理。3例正常男性样本作为分析对照。对明显的单外显子缺失的结果,需经PCR和测序进一步验证。2、应用DHPLC和测序技术筛查dystrophin基因微小突变运用DHPLC技术对MLPA检测为阴性的患儿进行进一步筛查。针对79个外显子及其侧翼序列设计引物,在UNOⅡ48型PCR扩增仪里分别进行PCR扩增。未纯化的PCR产物与同样条件扩增的男性对照产物等体积混合,进行变性及缓慢复性。DHPLC分析采用WAVE?核酸片段分析系统进行。首先经WAVEMARKER 4.1软件分析,确定dystrophin基因各扩增片段最佳分离梯度和检测温度。将上述经预处理的扩增产物直接用于DHPLC检测。对DHPLC检测出现峰形异常者用Beckman CEQ-8000遗传分析仪进行DNA测序。对变异的位点,通过检索单核苷酸多态性数据库或应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）的方法判定是否为SNP。结果1、MLPA分析结果患儿有一个或多个外显子缺失会导致其相应的MLPA产物的完全消失。44例经多重PCR检测未发现dystrophin基因大尺度缺失的DMD患儿DNA样本,经MLPA筛查后,发现11例（27.3%）存在外显子拷贝数的改变,其中4例为单外显子缺失,7例为多外显子缺失,未检测到重复突变。MLPA结果为单外显子缺失的4例患儿经PCR和测序分析后发现,有一例患儿（13号）实际上在第47外显子内部发生了微小缺失（c.68086811del）,并导致了提前终止密码子的产生（p.Leu2270MetfsX9）。2、DHPLC分析和测序结果由于DNA样本量的限制,我们只筛查了dystrophin基因45个外显子和3’UTR部分片段。结果分别在4例患儿中检测出该基因的4种致病突变,其中3例为未报道的新突变。两例移码突变c.19761980del和c.49594960insA分别导致p.Ser661ValfsX58和p.Ser1654LysfsX5,两例无义突变c.8656C＞T和c.8608C＞T分别导致p.R2886X和p.R2870X。其余的基因变异包括2个错意突变和7种内含子的变异。结论1、MLPA是一种优于mPCR的检测突变的新技术,具有灵敏度高,简单高速的特点。作为DMD的一线筛查技术,MLPA可以快速、准确、半定量地分析dystrophin基因79个外显子的拷贝数改变。2、DHPLC技术具有高准确性和敏感性等特点,能够有效筛查dystrophin基因的微小突变,可作为MLPA技术的有力补充。3、联合运用MLPA和DHPLC技术可以全面有效地检测DMD的致病突变,有望提高DMD的基因诊断和高危儿产前诊断技术水平,具有重要的临床应用价值。