本文研究目的：检测15-羟基前列腺素脱氢酶(15-Hydroxyprostaglandin dehydrogenase，15-PGDH)在大肠癌组织中的表达情况，确定其与大肠癌发病的相关性；构建15-PGDH原核融合表达体系；对原核表达培养条件进行研究，并应用优化条件对目的蛋白进行融合表达与分离纯化，以便进一步研究其生物学功能。 研究方法：采用山西省健康人大肠组织、大肠癌患者大肠癌组织及癌旁正常组织为实验标本。首先，对30例大肠癌患者大肠癌组织和癌旁正常组织应用免疫组化分析方法，检测15-PGDH在山西省大肠癌组织中的表达情况。然后，用RNA抽提试剂盒抽提健康人大肠黏膜组织总RNA，从Genebank获取15-PGDH的cDNA序列，利用primer premier 5.0软件设计引物，使其扩增产物中包含15-PGDH的编码序列并含有BamH-Ⅰ和Hind-Ⅲ双酶切位点。用反转录试剂盒及相应引物进行RT-PCR，PCR产物用低熔点琼脂糖凝胶切胶回收纯化，纯化的扩增产物和T载体进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有X-gal、IPTG且氨苄青霉素阳性平板中挑选白色菌落，扩种后提取质粒，用酶切和PCR方法进行鉴定，阳性质粒命名为pMD18T-15-PGDH；以pMD18T-15-PGDH为模板，用带His Tag的合适引物扩增目的片段，将扩增产物切胶回收纯化，以BamH-Ⅰ和Hind-Ⅲ对扩增纯化产物和pBV220质粒分别进行双酶切，然后将BamH-Ⅰ和Hind-Ⅲ双酶切后的目的片段和pBV220线性质粒连接，从而构建C端含有His Tag的pBV220-15-PGDH-His<,6>质粒。将重组质粒pBV220-15-PGDH-His<,6>转化大肠杆菌DH5<,α>，筛选出阳性菌株，并经测序进一步证实。同时进行pBV220-15-PGDH-His<,6>表达条件研究，并利用优化条件对质粒pBV220-15-PGDH-His<,6>进行温控诱导表达，超声破菌，包涵体的分离、洗涤、纯化、复性。复性后用超滤管离心浓缩，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。用Ni<'2+>-NTA树脂柱对表达产物进行纯化，进一步研究其生物学功能。 研究结果：免疫组化染色结果显示，15-PGDH在大肠癌癌旁正常组织和部分大肠癌组织中呈特异性表达，表现为细胞质内较均匀的棕黄色细颗粒状染色。其在大肠癌组织中的表达较癌旁5am正常对照组织显著减少，其中约1/3患者表达缺失，表明在大肠癌组织中确实存在15-PGDH表达减少甚至缺失现象，且其表达水平与大肠癌发病具有相关性；应用基因工程技术，成功构建了pBV220-15-PGDH-His6质粒表达载体；SDS-PAGE电泳及Western-blotting鉴定结果表明，在大肠杆菌DH5α中成功表达出15-PGDH-His<,6>融合蛋白，且优化条件为pBV220-15-PGDH-His<,6>/DH5α进入对数生长期时，42℃温控诱导表达6小时，目的蛋白得到高效表达，表达量占菌体总蛋白量的20％，经鉴定其表达形式为包涵体；用Ni<'2+>-NTA树脂柱纯化后获得纯度高达95％以上的15-PGDH-His<,6>融合蛋白纯品，且SDS-PAGE显示为单一区带。 研究结论： 1．用免疫组化分析方法，证实了15-PGDH与大肠癌发病有相关性； 2．应用基因工程技术，成功构建了原核融合质粒表达载体pBV220-15-PGDH-His<,6>； 3．建立了pBV220-15-PGDH-His<,6>/DH5α优化表达条件； 4．经Ni<'2+>-NTA树脂柱纯化获得15-PGDH-His<,6>融合蛋白纯品；