论文部分内容阅读
第一部分以成纤维细胞生长因子受体1为靶点的姜黄素类似物的抗肿瘤活性研究 目的： 1，根据前期的实验结果，合成并筛选出EF24类似物B6。 2，检测EF24与B6两种化合物对多种肿瘤细胞增殖的影响，揭示B6的抗肿瘤活性。 3，通过B6对肿瘤细胞NCI-H460细胞bFGF/FGFR下游信号蛋白表达的检测，了解B6促细胞凋亡的靶点及机制。 4，探讨EF24与B6在抗肿瘤药物开发过程中的作用及临床应用价值。 方法： 1，通过改造单羰基姜黄素类似物3，5-双（2-氟苯亚甲基）哌啶-4-酮(EF24)，合成了其类似物[3,5-双（2-溴苯亚甲基）哌啶-4-酮，B6]; 2，采用FGFR1酪氨酸激酶实验验证其靶向性; 3，MTT法检测EF24和B6对正常人肝细胞HL7702、4种肿瘤细胞（人大细胞肺癌NCI-H460、人胃癌细胞SGC-7901、人小细胞肺癌A549、人星形胶质瘤细胞株U251)增殖的影响; 4，WB法检测B6(2.5、5、10umol/L)对NCI-H460细胞bFGF/FGFR下游信号蛋白表达的影响; 5，Caspase-3试剂盒检测Caspase-3因子的表达。 结果： 1，根据EF24与B6对FGFR1酪氨酸激酶的活性分析，结果显示溴取代的EF24类似物B6表现出很好的抑制活性，相较于先导物EF24抑制效果有明显的提高和改善。 2，根据对多种肿瘤细胞的增殖活性抑制分析，结果显示EF24及其类似物B6对4种肿瘤细胞的半数抑制率均达到微摩尔级别，但是对正常肝细胞HL7702细胞抑制作用EF24类似物B6较差，表现出较弱的细胞毒性作用，相对EF24有较高的安全性。我们还能发现类似物B6对NCI-H460的IC50值相对其他肿瘤细胞要低很多，显示类似物B6对NCI-H460的增殖抑制具有很好的细胞选择性。 3，为了进一步探索EF24类似物B6对FGFR1的作用机制，因此在肿瘤细胞NCI-H460中检测其对FGFR1活化的影响，采用WB技术检测，结果显示活性类似物B6对NCI-H460中FGFR1及其下游信号分子AKT及ERK1/2活化有明显抑制作用，并且抑制效果较先导化合物EF24好。且随着化合物浓度的增加(2.5，5，10μM)，对FGFR1及其下游信号分子AKT及ERK1/2活化的抑制作用逐渐增强，表现出很好的剂量依赖性。 4，比较EF24及其类似物B6对NCI-H460细胞的促凋亡作用，5uM B6作用于NCI-H460细胞12h后能有效地诱导caspase3和9的表达，且强于先导化合物EF24。化合物EF24以及类似物B6作用于细胞后，凋亡蛋白caspase3酶的活性相对阴性对照组有明显增强。 结论： 1，EF24类似物B6有效地抑制了多种肿瘤细胞的增殖，并对NCI-H460有较好的选择性，且具有较高的安全性。 2，细胞内信号分子检测发现EF24类似物B6对bFGF/FGFR信号通路中FGFR1以及下游信号蛋白AKT和ERK1/2的活化具有很强的抑制作用，并呈现出良好的剂量依赖性，因此表明该类似物B6不仅可以抑制FGFR1激酶的活性，同时还可以抑制bFGF/FGFR信号通路中FGFR1以及下游的信号蛋白AKT和ERK1/2的活化，说明了类似物B6确实是FGFR1的抑制剂。 3，Western Blot实验结果进一步表明B6能有效地诱导caspase3和caspase9的表达，同时Caspase3试剂盒的检测结果也进一步验证了这一点。 4，通过先导物EF24设计改构获得的类似物B6体外对多种肿瘤细胞有增殖抑制作用，尤其是对NCI-H460细胞; 5，对FGFR1激酶有很好的抑制活性，也能明显抑制了FGFR1及下游增殖信号蛋白AKT及ERK1/2的活化，促进肿瘤细胞的凋亡，其效果较先导化合物有明显提高和改善，并具有更好的安全性。 6，通过细胞实验证明了以EF24为先导化合物合成靶向FGFR1的小分子抑制剂的思路是可行的，并具有很好的研发前景。 第二部分姜黄素类似物抑制炎症反应缓解Ⅰ型糖尿病肾损伤实验研究 目的： (1)实验验证单羰基姜黄素类似物WZ35的抗炎活性; (2)通过建立Ⅰ型糖尿病模型，观察WZ35对糖尿病肾病的缓解作用; (3)检测并观察WZ35对血清和肾脏组织中的炎症因子和趋化因子表达的影响; (4)初步探讨姜黄素类似物WZ35治疗糖尿病肾病(DN)的分子机制，为DN的治疗提供候选药物。 方法： (1)采用ip链脲佐霉素(STZ)的方法制备Ⅰ型糖尿病小鼠模型; (2)连续给药，每周测定各组小鼠的体重和血糖; (3)实验结束时生化分析仪检测血清中肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平; (4) HE染色观察肾组织病理性损伤情况; (5)采用RT-qPCR检测肾脏组织中炎症因子和趋化因子的表达; (6) CD68免疫组化染色检测肾脏组织巨噬细胞浸润情况。 结果： (1)与对照组相比，模型组小鼠体重下降，血糖升高，肾脏指数增加，血清中Cr和BUN水平升高，肾脏病理性损伤明显，肾脏组织中炎症因子和趋化因子表达明显增加，肾脏组织巨噬细胞浸润增加; (2)姜黄素及其类似物WZ35对模型小鼠质量、血糖和肾脏指数无明显影响; (3)姜黄素及其类似物WZ35能显著降低模型小鼠血清中Cr和BUN的水平; (4)姜黄素及其类似物WZ35能明显缓解Ⅰ型糖尿病引起的肾组织损伤; (5) WZ35较姜黄素抑制肾脏组织中的炎症因子和趋化因子的基因表达及巨噬细胞浸润强。 结论： (1)姜黄素极其类似物WZ35不能明显改善糖尿病引起的体重下降和血糖升高，但对于肾脏的损伤起到了明显的缓解作用; (2)姜黄素类似物WZ35不是通过降糖作用缓解糖尿病肾病; (3)姜黄素类似物能够通过抑制炎症反应缓解糖尿病肾病。 (4)对姜黄素和其类似物WZ35缓解糖尿病肾病的机制研究发现两者可通过抑制趋化因子ICAM-1的表达，降低糖尿病肾脏组织中巨噬细胞的浸润，减少炎症因子的表达从而缓解DN。