前言 慢性疾病相关性贫血是临床上最常见的血液系统异常之一。在其发生发展过程中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)的作用倍受关注。TNF-α是一种多功能的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和淋巴细胞产生。在造血方面，TNF-α对髓系细胞的增殖和分化发挥着正向和负向双重调节作用。TNF-α可以直接地或通过诱导其它细胞产生细胞因子而发挥作用。 TNF-α在体外和体内都能抑制红系造血。TNF-α长期在体内作用于裸鼠，可选择性地抑制红细胞生成，并伴有单核细胞的绝对增多。癌症患者接受TNF-α治疗后，血红蛋白明显下降。一些体外实验也都证实了TNF-α在红细胞集落形成上的抑制作用，但其发生机制目前还不十分清楚。 我们通过体外集落形成法，测定红细胞集落形成单位(CFU-E)，以及在多种细胞因子存在下液体培养CD34~+细胞，使之向红系分化，通过观察血型糖蛋白A(glycophorin A，GPA：一种特异的红系标记)阳性细胞的增生情况，探索哪一阶段的红系祖细胞对TNF-α敏感及与其相关的TNF受体(TNFRs)在红系祖细胞的表达情况。为阐明慢性疾病相关性贫血的发病机制奠定基础。 材料和方法 试剂 牛血清白蛋白(BSA)、Iscove’s Modified Dulhecco’s Medium(IMDM)及propidium iodide(PI)购自Sigma公司。胎牛血清(FCS)、青霉素、链霉素购自Flow Laboratories Inc。胰岛素购自Calbiochem。异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD34抗体购自Becton Dickinson公司。藻红蛋白(PE)标记的抗血型糖蛋白A(GPA-PE)购自DAKO公司。抗TNFRⅠ-PE和抗TNFRⅡ-PE购自R&D公司和Caltag实验室。重组人TNF-α由Mochida Pharmaceutical公司惠赠。重组人促红细胞生成素(EPO)由Chugai Pharmaceutical公司惠赠。重组人白细胞介素3(IL-3)和干细胞因子(SCF)由Kirin Brewery公司惠赠。维生素 B12 和叶酸购自 Sankyo Ph。aceuhcd公司。 人 CD34”细胞的纯化 给正常健康志愿者注射重组人粒细胞刺激因子（G－CSF人动员CD34”细胞进人外周血，用细胞分离机分离并收集外周血单个核细胞，再用免疫磁珠分离、纯化 CD34”细胞，置液氮中冻结保存备用。 祖细胞的半固体培养 用平底 48孔的组织培养M，采用含血清的纤维素半固体法进行 CD34”细胞及其祖细胞的集落培养。细胞浓度为500什ml。培养基中含有EPOZu／ml，IL－3 50n／rnl及 SCF 50n牙Inl。TNF－。浓度依次为0、In才ml、10ng／rnl上 和 1000ng／Inl。在 37T，5％CO。浓度，5％O。浓度下孵育一定天数后，固定，联苯胺苏木精染色。将含有8－49个血红素染色的细胞聚合体规定为CF’U－E。 纯化的CD34”细胞的液体悬浮培养 将冻结的外周血 CD34”细胞解冻，悬浮于 IMDM（含30％FCS和 100U／rnl DNA酶）中，然后在4009，4℃下高速离心smin，去上清，洗细胞二次，再悬浮于含 0．3％去离子 BSA的 IMDM中。将 0．5 X 10‘－2．0 X 10VInl的细胞液悬浮于下列混合物中：20％FCS，10％热灭活库存人 AB血清，二％鹏A，胰岛素10 m旷Inl，维生素＊2 10卜算Inl，叶酸15卜4rnl，IL－3 10oU／Inl，SCF 100 ＂g／Inl，EPO 4 U／Inl，p－ME 5 x 10－’mo＊Inl，青霉素 50 U／rnl，链霉素50 U／rnl和IMDM。在37t，5％COh95％大气压下孵育规定的天数后，收集细胞，测定细胞扩增倍数和表面标记。 流式细胞仪分析 细胞由染色介质冲洗2次，用FITC和PE标记的单克隆抗体染色，然后经 FACS（荧光激活细胞分类器）Calibur分析。 统计学分析 差异检验采用 Stat View 4．oin软件的单因素方差分析瞩cheffe’s Pot＊hoe test）。 结 果 TNF－a对纯化的CD34”细胞集落形成的影响 ·2· 用于本研究的人 CD34”细胞的纯度为 98．5％。1．0％（mean。SD入0．SInl培养基中细胞浓度 1，000／rnl，EPO 2 U／Inl，IL－3 50 U／ml和 SCF 50U／血。TN F－a浓度为O＊，00O n牙ml。结果显示TN F－a降低了代表原始增殖能力的大型红系集落（超过50个幼红细胞）形成的数量。而由8－49个幼红细胞构成的中等大小的红细胞集落明显增多。在TNF－a浓度超过 100 n牙nil时也并不抑制这些细胞的集落形成。由于 CD34”细胞中产生大型集落的红系祖细胞占绝大部分，因此TNF－a似乎降低了红系祖细胞的增殖能力。但在浓度为 l－100 n矿Inl范围内，TNF－a促进非红系集落的生长。 TNF－a对 CD34”细胞由来的 GPA”细胞增生的抑制作用 将纯化的 CD34”细胞在液相 与几一3，SCF，EPO及 TNF－a（10 n矿Inl）共同培养，以诱导红系的分化。在孵育7天之后，用FACS检测总细胞数及增殖细胞的构成，重点观察红系的特征性标记物GPA的表达。结果显示，TNF－a使GPA”细胞的数量显著减少，表明TNF－a抑制CD34”细胞由来的 GPA”细胞的增殖。 TNF－a在红系造血早期阶段的作用 为了探索 TNF－a对红系祖细胞发育阶段的影响，将 CD34”细胞与几J，sc