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猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。该病已给各国的养猪业造成了严重的经济损失,因此关于其疫苗的研制迫在眉睫。本研究制备了PEDVM和S蛋白的多克隆抗体,利用原核表达的S蛋白建立了间接ELISA方法,还利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达了M、E和S蛋白,成功构建了PEDV病毒样颗粒(VLPs),并对其免疫特性进行了研究,PEDV VLPs的构建和免疫特性研究为PEDVVLPs疫苗的研制奠定了基础。具体研究内容如下：1.猪流行性腹泻病毒M和S蛋白多克隆抗体的制备及鉴定本研究采用PCR方法对猪流行性腹泻病毒(PEDV) M蛋白和S蛋白的亲水区基因进行扩增,扩增片段(命名为Ma和Sa)分别克隆到原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pET-32a-Ma 和 pGEX-6p-1-Sa转化大肠杆菌BL-21菌株,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定。表达产物经SDS-PAGE电泳后切胶免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测小鼠免疫后血清效价,Western-blot和间接免疫荧光检测抗体的特异性。结果表明目标蛋白获得了正确表达,且制备的多克隆抗体具有较高的敏感性和特异性。PEDV Ma和Sa蛋白的表达及多克隆抗体的制备将为进一步构建PEDV的病毒样颗粒(VLPS)抗原和建立血清学检测方法奠定了基础。2.PEDV Sc蛋白间接ELISA方法的建立及其与中和试验相关性的研究本研究应用原核表达载体pET-28a (+)表达了PEDV S蛋白的截短片段(命名为Sc),并利用纯化的Sc蛋白建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法。通过筛选确定,抗原最佳包被浓度为1 gg/mL,包被条件为37℃ 2 h,最佳封闭液为5%脱脂乳,封闭时间为2 h,血清最佳稀释度为1：100,作用时间为1 h,二抗最佳稀释度为1：20000,作用时间为45 min,最佳显色时间为15 min。通过对80份PEDV阴性血清间接ELISA结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为：当OD450nm≥0.259时判为阳性,当OD450nm≤0.223时判为阴性,介于两者之间判为可疑。本方法的批内重复性和批间重复性变异系数均小于100%，敏感性实验证明5份阳性血清1：3200稀释后检测仍为阳性,说明本方法具有良好的重复性和敏感性。使用本研究建立的间接ELISA方法检测PRV、PCV2、FMDV、PRRSV和CSFV的标准阳性血清,结果均为阴性,说明本方法具有良好的特异性。运用本方法筛选的OD4sonm值递减的7份血清样品做中和试验,结果中和抗体效价基本保持递减趋势,说明本研究建立的间接ELISA方法可信度高,可用于检测PEDV中和抗体。3. PEDV病毒样颗粒的构建和免疫原性的研究本研究通过PCR方法扩增了PEDV的M、E和S基因,先后将M和E基因克隆到昆虫杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac Dual的PH和p10启动子后,构建重组质粒pFast-ME,将S基因克隆到pFastBac Dual的PH启动子后,构建重组质粒pFast-S。分别将重组质粒pFast-ME和pFast-S转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经2轮蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得正确的重组杆粒Bacmid-ME和Bacmid-S.在脂质体的介导下,分别用Bacmid-ME和Bacmid-S转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBME和rBS。用重组杆状病毒rBME和rBS共同感染Sf9细胞,收获细胞后经Western-blot鉴定,M、E和S蛋白均得到正确表达。将共感染收获的细胞经蔗糖密度梯度离心纯化后电镜观察,结果证明M、E和S 3种蛋白可以组装形成PEDV病毒样颗粒。将VLPs样品制成疫苗,免疫小鼠,通过ELISA实验和中和试验检测发现VLPs能诱导机体产生ELISA抗体和中和抗体。以上结果说明杆状病毒表达的M、E和S蛋白在昆虫细胞中组装形成了VLPs,为研制VLPs疫苗奠定了基础,具有良好的应用前景。综上所述,本研究制备了PEDV M和S蛋白的多克隆抗体,利用截短表达的S蛋白建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法,并成功利用杆状病毒表达的M、E和S蛋白在昆虫细胞中组装形成了VLPs,为PEDV血清学诊断技术和VLPs疫苗的研制奠定了基础。