论文部分内容阅读
目的：依据基因BANK中基因序列设计相应引物克隆出人干扰素α-2b基因序列，构建多种重组人干扰素α-2b的原核分泌型表达载体，转化至大肠杆菌BL21和大肠杆菌W3110的感受态细胞中。分析不同宿主细菌对目标蛋白的表达量和分泌效率的影响，经SDS-PAGE,Westernblot等手段鉴定获得较为理想重组人干扰素α-2b的原核分泌型工程菌株pPSIFN-4L/E.co/iW3110。方法：根据大肠杆菌编码基因密码子的偏爱性原则，在不改变huIFN-α2b原有氨基酸序列的前提下，定向突变huIFN-α2b编码基因5’端得序列并且PCR扩增出huIFN-α2b＇基因，克隆至pGEM7zf(-)中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝-白斑筛选及测序验证正确；设计引物从大肠杆菌基因组中克隆出STⅡ信号肽基因序列，用同样方法验证正确。利用重叠PCR技术实现STⅡ信号肽基因和huIFN-α2b＇基因的融合，再分别引入酶切位点BamHI/SalI,NdeI/HindⅢ以及NsiI/XhoI将融合基因片段STⅡ-huIFN-α2b＇克隆至载体pCSE、pET-22b和pPAK4L中，构建分泌型表达载体pCSIFN、pESIFN-22b和pPSIFN-4L。pCSIFN转入大肠杆菌W3110，pESIFN-22b转入大肠杆菌BL21，pPSIFN-4L分别转入大肠杆菌BL21和大肠杆菌W3110。诱导表达目标蛋白，将表达产物进行SDS-PAGE，使用WesternBlot免疫印迹法分析验证并用WISH-VSV系统细胞病变抑制法(CPE)来测定表达的目标蛋白抗病毒活性及其效价。结果：融合基因在载体pCSE中表达量很低，其中约有50％的目标蛋白能够成功实现分泌。在E.coliBL21中，pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达，但在分泌过程中STⅡ信号肽不能被有效切除。含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coliW3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达，经过低磷诱导其表达量最高可至20μg/ml(A550)菌液，约有30％的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中。Westernblot表明目标蛋白具有与huIFN-α2b标准品相同的免疫原性；离心收集菌体，加入一定量的PBS(pH8.0)反复冻融后取上清液，WISH-VSV系统证实其总活性达1.425×l05IU/ml，相对的包涵体表达体系作为对照其总活性为1.259×103IU/ml。
结论：成功构建5’端突变的huIFN-α2b原核分泌型表达工程菌pPSIFN-4L_E.coliW3110，其表达量以及分泌效率均达到较高水平。