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四氯双酚A(TCBPA)是一种重要的氯代双酚类结构类似物,因具有优异的阻燃性能,故被世界各国作为阻燃添加剂大量应用到各类材料中,TCBPA在环境中分布广泛且保有量巨大,目前在水体、土壤、甚至生物体中均有发现。由于TCBPA为有机质,因此易吸附在生物体表面而被吸收进入生物体,并通过食物链的级联作用在高等生物中大量累积,进而对环境及生物体健康造成严重危害。然而,目前对TCBPA的生物毒性及致病机理仍知之甚少,虽然TCBPA在环境中分布广泛,但浓度较低,一般维持在微克级别;因此,了解TCBPA在低浓度下对生物的毒性更具现实意义。本实验选用被广泛使用的真核模式生物酿酒酵母作为研究材料,对低浓度TCBPA胁迫下的生物毒性进行了评估,并对其毒性诱发的机制进行了初步探究,使人们更深入了解TCBPA的毒性,以期为后续将要继续进行的TCBPA对人类等高等生物的毒性损伤研究提供理论依据。首先,将酿酒酵母暴露于低浓度TCBPA(0、5、10和20 μM)胁迫下,利用分光光度计及蓝白染色检测TCBPA对酿酒酵母生长及存活所造成的影响;并利用血球计数板显微观察测定酿酒酵母在对数期时的细胞溶胀率,以初步评估低浓度TCBPA对酿酒酵母细胞膜的损伤。结果显示,TCBPA在5 μM剂量下并未对酿酒酵母的生长、存活及细胞膜产生显著影响,但在10和20 μM剂量下,酿酒酵母的生长、存活及细胞膜均受到了显著影响,且损伤程度随着TCBPA剂量的增加而加剧。此外,我们利用荧光探针DCFH-DA对不同浓度TCBPA胁迫下,酿酒酵母胞内活性氧(ROS)的含量进行了测定,并分别利用硫代巴比妥酸法、JC-1荧光探针以及UHPLC-MS/MS级联酶反应器酶解联用的检测手段,对酿酒酵母在TCBPA胁迫下胞内MDA含量、线粒体膜电位以及8-oxodG水平进行了分析,评估低剂量TCBPA对酿酒氧化损伤情况。结果表明,低剂量TCBPA能够促使酿酒酵母胞内ROS含量显著增加,并因此造成脂质过氧化、线粒体膜电位降低和DNA损伤。然后,本课题组通过查阅文献,首先确认了与ROS产生相关的若干条信号途径(可分别概括为钙离子相关途径、MAPK途径和酪氨酸激酶途径);在此基础上,利用荧光探针Fluo-2 AM对低浓度TCBPA胁迫下酿酒酵母细胞内钙离子浓度进行检测,并通过DPI抑制NADPH氧化酶、EGTA螯合钙离子、FK506抑制钙调磷酸酶、购买BCK1及MCK1基因敲除菌株等方式,分别特异性阻断了钙离子相关途径、MAPK途径和酪氨酸激酶途径,进而测定酿酒酵母在各通路关键酶受到抑制情况下胞内ROS的含量变化。结果显示,TCBPA可使酿酒酵母胞内钙离子含量显著升高;当干扰酿酒酵母对Ca2+吸收,抑制钙调磷酸激酶,NADPH氧化酶以及敲除BCK1、MCK1基因时,TCBPA胁迫导致的酿酒酵母细胞内ROS积累程度现了一定程度的减少。最后,利用实时荧光定量PCR技术,对酿酒酵母细胞中产ROS相关通路关键酶基因的表达情况进行了检测;结果表明,低浓度TCBPA可促使酿酒酵母细胞内酪氨酸激酶通路、钙离子相关通路、MAPK通路及呼吸链中关键酶基因的表达,并可促进ROS清除途径中超氧化物歧化酶(SOD)基因的表达,而抑制氧化氢酶(CAT)基因的表达。这些结果表明,TCBPA可通过多条途径激活NADPH氧化酶,促进酿酒酵母产生ROS,且通过抑制ROS末端清除途径,使ROS在酵母胞内快速积累。过量的ROS破坏酵母细胞氧化平衡状态,进而引起氧化损伤,并最终导致酿酒酵母生长受阻甚至凋亡。