中晚期宫颈癌致死率高,现有治疗手段疗效有限,仍是全球女性健康的一大威胁。宫颈癌是由DNA致瘤病毒所致,HR-HPV持续感染而形成的实体性肿瘤。近年来,自噬在肿瘤和感染性疾病中的作用越来越受到重视,调控自噬有望作为一种新的治疗手段应用于临床。但关于HPV癌蛋白如何调控自噬及自噬在宫颈癌发生发展中的作用,目前研究甚少。本研究中,我们首先确定了在宫颈癌细胞中HPV 16E6/E7表达下调可抑制自噬,并可能是在自噬的起始阶段进行调控。在HEK293细胞中过表达16E6或16E7后,自噬体合成增加且降解加快。用药物或RNAi技术破坏自噬后细胞增殖减少、早期凋亡数目增加,细胞活力受限。而用自噬诱导剂则能抑制细胞凋亡。进一步,我们用RNA测序及生物信息学分析的方法在586个差异表达基因中筛选出Atg9B和LAMP1可能是16E6/E7调控自噬过程中的关键分子。下调Atg9B后LC3-Ⅱ表达降低,而干扰LAMP1表达后LC3-Ⅱ表达累积。在16E6/E7低表达的SiHa和CaSki细胞中过表达Atg9B可使LC3-Ⅱ累积,而过表达LAMP1则LC3-Ⅱ降解加快。后续的一系列实验证实,16E7则与Atg9B直接结合,促进自噬体的生成然后转运至溶酶体发生融合后加速其降解,16E6通过与启动子特定区域结合在转录水平上调Atg9B和LAMP1表达。我们的结果提示,HPV 16E6E7通过Atg9B和LAMP1途径激活宫颈癌细胞自噬,从而维持宿主细胞活力。我们的发现为宫颈癌靶向自噬治疗提供了证据。第一部分 自噬在宫颈癌细胞中的作用目的:用药物和基因干扰技术等明确HPV 16E6/E7在宫颈癌细胞系中对自噬的调控作用。方法:首先,应用小RNA干扰技术在HPV16阳性的宫颈癌细胞系SiHa和CaSki下调HPV16早期癌蛋白E6、E7(16E6/E7)的表达,并分别加以自噬诱导剂EBSS、自噬阻断剂Baf A1或CQ的作用,WB实验验证干扰效率并检测对自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达的影响。其次,间接免疫荧光实验用来检测干扰16E6/E7后对LC3-Ⅱ绿色荧光斑点数目的影响。然后,mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒转染宫颈癌细胞后再用小干扰RNA下调16E6/E7的表达,激光共聚焦显微镜下分别观察并计数绿色和红色荧光斑点的数目,并进行比较。最后,分别构建16E6和16E7的过表达质粒,转染HEK293细胞,并加以自噬诱导剂EBSS和/或自噬阻断剂CQ的作用,WB实验检测对自噬标记蛋白LC3-Ⅱ的影响。在宫颈癌细胞SiHa中筛选自噬诱导剂rapamycin、自噬抑制剂3-MA和自噬阻断剂CQ的最适作用浓度,并将这筛选出来的最适浓度应用于后续实验。用3-MA和CQ分别作用于SiHa和CaSki细胞,用CCK-8试剂盒检测对细胞增殖的影响。用小干扰RNA下调Atg5的表达,WB实验验证下调效率后同样用CCK-8检测对细胞增殖的影响。Rapamycin、3-MA、CQ分别作用于SiHa和CaSki细胞,AnnexinV联合PI法检测对细胞早期凋亡的影响。用小干扰RNA下调SiHa细胞中Atg16L1的表达,WB实验确定干扰效率,Annexin V联合PI法检测对细胞早期凋亡的影响。结果:1.下调16E6/E7可抑制LC3-Ⅱ表达,加用EBSS、Baf A1或CQ后这种现象仍然存在。下调16E6/E7可使自噬体的形成减少。2.上调16E6或16E7后LC3-Ⅱ表达减少,但在加入CQ作用后上调16E6或16E7可使LC3-Ⅱ表达累积。3.用3-MA、CQ或小干扰RNA破坏宫颈癌细胞自噬后,细胞增殖减少、早期凋亡增加。而用rapamycin诱导自噬后,细胞早期凋亡数目减少。结论:1.HPV 16E6/E7可以在起始阶段维持宫颈癌细胞中的自噬。2.一定程度的自噬激活有助于维持宫颈癌细胞的活力。第二部分RNA测序及生物信息学分析筛选并验证HPV16 E6E7调节自噬过程中的下游信号分子目的:RNA测序及生物信息学分析筛选并验证HPV 16E6/E7在宫颈癌细胞中调控自噬的下游信号分子。方法:首先,我们在宫颈癌细胞系SiHa中转染小干扰RNA以下调16E6/E7的表达,RT-PCR检测并确定干扰效率后准备样品送RNA测序(以阴性RNA转染的SiHa细胞为对照组,并每组设3次生物学重复)。提取出来的细胞总RNA在经过质量检测等一系列实验后建立cDNA文库,用Hi-seq 2500测序平台进行测序。测序结果经过比对分析后筛选出差异表达基因。然后,对这些差异表达基因进行KEGG和GO分析,并筛选与自噬通路相关的差异表达基因为候选分子。在SiHa和CaSki细胞中分别对候选分子进行mRNA和蛋白水平的表达验证,确定最终的下游分子。最后,进一步对下游分子进行在亚细胞结构分布的验证,并确定下游分子对自噬的影响。结果:1.RNA测序总共得到586个差异表达基因,其中包括193个上调表达基因和393个下调表达基因。2.KEGG分析可知差异基因主要集中在代谢通路、细胞周期通路、肿瘤信号通路上,GO细胞成分分析可知差异表达基因主要集中在细胞器、细胞核上。3.生物信息学显示与自噬调控通路相关的差异表达基因有4个,分别是SPATA18、RGS19、Atg9B 和 LAMP1。4.SiHa细胞中,干扰16E6/E7后,这四个分子的mRNA水平的改变趋势都与RNA测序结果相同,即干扰16E6E7后SPATA18、RGS19mRNA水平升高而Atg9B和 LAMP1 mRNA 水平降低。而在 CaSki 细胞中 SPATA18、RGS19、LAMP1 mRNA的改变趋势都与SiHa相同,但是Atg9B mRNA水平在干扰16E6E7之后却升高。5.Si-16E6E7 干扰 SiHa、CaSki 细胞后 SPATA18、RGS19、Atg9B、LAMP1蛋白表达水平都降低。6.干扰SPATA18、RGS19、Atg9B的表达后LC3-Ⅱ表达下降,干扰LAMP1表达后LC3-Ⅱ表达累积。7.进一步验证Atg9B和LAMP1在亚细胞结构中的分布,发现Atg9B和LAMP1主要分布在细胞器膜上,且干扰16E6/E7后表达下调明显。结论:Atg9B和LAMP1可能是16E6/E7调控宫颈癌细胞自噬过程中的下游信号分子。第三部分 16E6、16E7调控Atg9B和LAMP1的机制研究目的:确定Atg9B和LAMP1参与16E6/E7调控宫颈癌细胞自噬,并阐明16E6/E7对Atg9B和LAMP1的调控机制。方法:首先,我们在16E6/E7下调的宫颈癌细胞系SiHa和CaSki中上调Atg9B和/或LAMP1的表达,确定Atg9B和LAMP1参与16E6/E7调控宫颈癌细胞自噬。其次,在HEK293细胞中分别转染16E6和16E7的过表达质粒,激光共聚焦显微镜观察其对Atg9B和LAMP1分布的影响。然后,在HEK293细胞中共转染Atg9B和LAMP1的过表达质粒,激光共聚焦显微镜下观察两者是否存在共定位。分别进行16E6、16E7和Atg9B、LAMP1的免疫共沉淀实验,确定是否存在相互作用。进一步,共转染16E7、Atg9B和LAMP1过表达质粒,激光共聚焦显微镜下观察是否存在共定位。在NCB1数据库中查找并确定Atg9B、LAMP1的基因启动子区,构建荧光素酶质粒。双荧光素酶基因启动子报告系统检测16E6与这两个基因的启动子区是否存在相互结合。RT-PCR确定16E6对Atg9B和LAMP1 mRNA表达的影响。JASPAR数据库预测16E6与Atg9B和LAMP1启动子区的可能结合位点,并根据预测结果构建Atg9B和LAMP1启动子区序列截短的荧光素酶质粒,再次用双荧光素酶基因启动子报告系统检测16E6是否与之结合并比较荧光强度的改变程度。综合分析预测和实验结果,推测16E6与Atg9B和LAMP1启动子区可能的结合位点。结果:1.小RNA下调16E6E7表达后单独上调Atg9B的表达使LC3累积,下调16E6E7后单独上调LAMP1的表达使LC311消耗增加,下调16E6E7后同时表达Atg9B和LAMP1,LC3-Ⅱ的表达介于上述两者之间。2.激光共聚焦显微镜下观察到16E6、16E7过表达能使LAMP1荧光斑点分布变得弥散,但对Atg9B没有影响。3.激光共聚焦显微镜观察到Atg9B和LAMP1可能存在共定位。4.免疫共沉淀实验显示16E7和Atg9B之间可能存在互相结合,但却没有发现16E7与LAMP1之间的相互结合。5.激光共聚焦显微镜观察到16E7作用下Atg9B和LAMP1之间仍存在共定位。6.双荧光素酶基因启动子报告系统提示16E6可以调控Atg9B和LAMP1基因的转录。7.JASPAR 数据库预测 16E6 与 Atg9B 基因中-720nt 到-710nt、-1085nt 到-1075nt、-1857nt 到-1860nt 及 LAMP1 基因中-700nt 到-690nt、-1265nt 到-1255nt、-1880nt到-1870nt结合的可能性最大8.双荧光素酶基因启动子报告系统提示Atg9B基因启动子中的-1750nt到-2000nt、LAMP1基因启动子中的-1800nt到-2000nt与16E6结合的可能性最大。结论:1.16E7与Atg9B相互作用,然后转运至溶酶体发生降解,促进自噬。2.16E6促进Atg9B和LAMP1的转录调控,在基因转录水平对自噬进行调控。