论文部分内容阅读
目的:日本血吸虫酪氨酸3-/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白基因（Schistosoma japonicum tyrosine3-monooxygenase/tryptophan5-monooxygenase activation protein，SjTAP），已知可能是具有抗血吸虫感染的免疫保护性基因;同时，SjTAP是在与钉螺组织共培养日本血吸虫母胞蚴体内呈差异性上调表达的基因，还可能是影响母胞蚴生长发育的关键基因。本课题在此基础上，对TAP蛋白在日本血吸虫成虫和母胞蚴体内的组织学分布进行了定位，并进一步研究其抗血吸虫感染的免疫保护性作用，及其在钉螺头足部组织浸出液共培养体系中对日本血吸虫母胞蚴生长发育的调控作用及机制。 方法:利用分子生物学方法，构建PET28a(+)-SjTAP重组表达质粒，大量诱导表达并纯化重组TAP蛋白;以重组TAP蛋白免疫小鼠制备免疫血清。免疫荧光组织化学染色法检测TAP在日本血吸虫成虫和母胞蚴体内的组织分布与定位;重组TAP蛋白定期免疫小鼠6周后血吸虫尾蚴攻击感染，42天后统计各组小鼠的虫荷数和每克肝脏的虫卵负荷，计算减虫率与减卵率，评价SjTAP的免疫保护性效果。实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测与钉螺头足部组织浸出液(protein extracts of O.hupensis head-foot tissue，PHF)共培养第1、3、4、8天母胞蚴TAP mRNA的表达水平;设计SjTAP特异性siRNA，浸泡法饲喂培养的日本血吸虫母胞蚴，real-time PCR检测RNAi干扰后母胞蚴体内TAP的表达水平，同时观察和测量母胞蚴体长、体宽和体积等生长发育指标变化及其存活率;添加钉螺头足部组织浸出液，RNAi干扰后，real-time PCR及免疫荧光组织化学染色法分别检测各组母胞蚴体内TAP基因和蛋白的表达水平变化，并观察和测量各组母胞蚴的生长发育变化及存活率情况。 结果:成功构建了含774bp SjTAP的PET28a(+)-SjTAP重组表达质粒，获得35kDaTAP重组表达蛋白。免疫荧光组织化学染色结果显示TAP蛋白特异性红色荧光颗粒广泛分布于日本血吸虫雌、雄成虫的皮层、皮下层、肌层和实质层，其中，在雌虫的皮层及卵巢周围、雄虫的皮层和皮下层，TAP荧光颗粒呈明显线状分布，在其它部位组织中则呈弥散性分布，仅局部组织有增强。重组TAP蛋白的免疫保护性实验结果显示:免疫组的减虫率为39.9％，减卵率为71.8％;佐剂对照组减虫率为10.8％，减卵率为59.7％;二者组间差异均具有显著性(p＜0.05)，表明TAP重组蛋白对血吸虫感染具有一定的免疫保护性。 Real-time PCR结果显示:与对照组比较，与钉螺头足部组织浸出液共培养组母胞蚴TAP基因mRNA的表达水平，从培养第3天开始显著上升，在培养第3、4和8天分别上升6.64倍、2.64倍和6.27倍(p＜0.01)。免疫荧光组织化学染色结果显示TAP蛋白主要表达在母胞蚴的体壁和胞质中。RNAi干扰实验结果显示，30nM的SjTAP siRNA即可显著抑制母胞蚴TAP基因的表达，使其mRNA表达水平降低93.45％。干扰第6天，SjTAP siRNA组(siTAP)母胞蚴体长、体宽、体积和存活率分别为87.23±6.29μm、47.52±3.15μrm、128276.36±26920.07μm3和89.2％，与siRNA对照组（sictrl）虫体体长112.45±11.6μm、体宽46.74±3.13μm、体积169004.73±40326.01μm3和98％存活率相比较，siTAP组母胞蚴体长明显缩短、体积变小、存活率降低(p＜0.05)。添加钉螺头足部组织浸出液后，实验分为四组:sictrl、siRNA对照组+1％钉螺头足部组织浸出液共培养组（sictrl+1％PHF）、siTAP、SjTAP siRNA+1％钉螺头足部组织浸出液共培养组(siTAP+1％PHF);在培养第6天，sictrl+1％PHF共培养组母胞蚴的TAP mRNA表达水平较sictrl组显著升高(p＜0.05);以TAP siRNA沉默TAP基因后，siTAP+1％PHF组母胞蚴的TAP mRNA表达水平与sictrl+1％PHF组母胞蚴比较明显下降(p＜0.05);免疫荧光组织化学染色结果显示四组母胞蚴体内TAP的荧光表达强度与其mRNA水平一致。光镜下，在培养第6天，siTAP组母胞蚴与sictrl组比较，其体长、体宽、体积均均明显减少，存活率显著降低(p＜0.05);sictrl+1％PHF与sictrl组、sictrl+1％PHF与siTAP+1％PHF组、siTAP+1％PHF与siTAP组两两比较，前者母胞蚴的体长、体宽和体积等均值明显较大(p＜0.05)，虫体存活率也较高(p＜0.05)。 结论:成功构建了SjTAP的重组表达质粒，表达获得了35KD的TAP重组蛋白。在日本血吸虫成虫体内，TAP蛋白主要表达于雌雄成虫的皮层、皮下层、肌层和实质层，在皮层呈线性分布，其它部位呈弥散性分布;重组TAP蛋白具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护性作用。在日本血吸虫母胞蚴体内，TAP蛋白主要表达于其体壁和胞质中，且随培养时间的延长体壁上的表达量逐渐增加;TAP基因具有促进母胞蚴的生长发育和存活作用;与钉螺组织共培养体系中，钉螺头足部组织浸出液是通过上调母胞蚴TAP基因的表达，进而发挥其促进母胞蚴生长发育与生存能力的作用。