论文部分内容阅读
EREBP转录因子在植物发育、环境胁迫及防御反应等方面具有重要作用，本研究通过酵母单杂交技术首次从棉花中分离了两个编码类EREBP的cDNA片段，命名为GhEREB2和GhEREB3。GhEREB2和GhEREB3编码的蛋白都含有一个高度保守的AP2/EREBPdomain、一个核定位信号和一个激活域，且与一些EREBP转录因子的相似性比较高，推测其属于EREBP转录因子家族的B3亚族。GhEREB2和GhEREB3具有较高的相似性，尤其是AP2/EREBPdomain的相似性更高，为97.4％。GhEREB2和GhEREB3基因的编码阅读框内都有一个内含子，且位于AP2/EREBPdomain区域外。RT-PCR分析表明，GhEREB2在棉花的根、茎和叶都表达，而GhEREB3仅在叶表达。GhEREB2和GhEREB3的表达被乙烯和JA诱导，且乙烯诱导的强度大于JA，但JA处理时，GhEREB2和GhEREB3mRNA积累的速度较快。干旱和低温能诱导GhEREB2的表达，但不能诱导GhEREB3的表达。另外，GhEREB2、GhEREB3能在原核生物中高效表达，且特异地识别、结合GCC-box，并激活报告基因His3和LacZ的表达，表现出明显的转录激活能力。将GhEREB2、GhEREB3基因分别构建到pCAMBIA1304表达载体，通过农杆菌转化法转入野生型拟南芥，得到经PCR证实的T1代转基因拟南芥的种子。以上研究表明，GhEREB2或许作为一个正调控的转录因子参与生物和非生物胁迫的信号转导途径，而GhEREB3或许仅作用于生物胁迫的应答反应。
WD-repeat蛋白在信号转导、蛋白运输和RNA加工等过程中具有重要作用，而植物中WD-repeat蛋白的研究比较少。本研究通过菌落原位杂交法从棉花中克隆到一个长1156bp的cDNA片段，命名为GhWDR，其编码蛋白的N-末端有四个WD基元，且与拟南芥、水稻、哺乳动物及酵母等真核生物的WD-repeat蛋白有明显的相似性，推测其属于WD-repeat蛋白家族的一个新成员。RT-PCR分析表明，GhWDR基因在棉花的根、茎和叶都表达，但表达量不同。此外，GhWDR基因在原核生物中也能高效的表达。将GhWDR基因构建到植物表达载体pCAMBIA1304，通过农杆菌转化法转入野生型拟南芥。PCR和GUS检测证实，GhWDR基因已经整合到拟南芥的基因组，且能稳定表达。转基因拟南芥的T1代种子对潮霉素的抗性发生了分离，部分株系的分离比接近3∶1，而其它株系的分离比远远高于或低于3∶1。T2代转基因拟南芥的营养器官和生殖器官都表现出GUS活性，但表达强弱不同，在生理活性旺盛的部位，如根尖分生区、苗期的子叶和真叶以及根、茎、叶和花丝的维管系统，表现出明显的GUS活性，而根毛、根冠、萼片、花瓣、花药、雌蕊及种子(种柄除外)等部位的GUS活性不明显。TMpredServer和PSORT6.4软件预测，GhWDR位于细胞质，可能与膜系统结合，且转基因拟南芥叶表皮细胞的GUS染色表明，GhWDR主要位于细胞壁附近和叶绿体，分析其可能通过结合细胞膜或叶绿体膜而发挥其调控功能。另外，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥侧根和不定根发达，叶片明显变大，生长速率加快，抽苔、开花期提前一周。以上研究表明，GhWDR基因属于WD-repeat家族，可能参与蛋白质的合成和物质的运输，从而促进植物的生长和发育。