【摘 要】
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研究目的:采用分子生物学技术,构建青蒿花粉cDNA表达文库,为今后利用文库筛选重组抗原候选分子进行研究提供材料来源,给进一步建立对蒿属花粉变态反应病的有效的诊断方法和治
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研究目的:采用分子生物学技术,构建青蒿花粉cDNA表达文库,为今后利用文库筛选重组抗原候选分子进行研究提供材料来源,给进一步建立对蒿属花粉变态反应病的有效的诊断方法和治疗奠定基础.研究方法:用Trizol液、氯仿、异丙醇、75％乙醇等试剂,从青蒿花粉中获得花粉总RNA;用生物素Oligo(dT)分离纯化mRNA;用含NotI内切酶识别序列的引物,反转录合成cDNA第一链;用DNA聚合酶,合成cDNA第二链;双链cDNA与EcoR I衔接子连接,经磷酸化及NotI酶切消化后,得到具有5EcoR I粘端、3NotI粘端的双链cDNA;分级分离纯化回收cDNA片段,在T<,4>DNA连接酶的作用下,将之定向插入λExCell Not I/EcoR I/CIP载体;重组子经体外包装后,转染大肠杆菌NM522,以测定文库容量.将噬菌体包装液铺蓝白斑选择平板,顶琼脂中含有IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)及X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷),计数平皿上出现的蓝斑及无色亮斑数目,检测重组率.根据重组载体λExCell Not I/EcoR I/CIP臂插入位点邻近区域的上、下游碱基序列设计引物,随机挑取16个噬菌斑做PCR鉴定,琼脂糖电泳分析插入片段的大小.研究结果:我们构建的蒿属花粉cDNA文库含5.6×10<5>个重组子,重组率为100％,文库中插入cDNA的平均大小为1.2kb.说明该文库适于筛选各种丰度mRNA的cDNA克隆.结论:应用分子生物学定向克隆技术,我们成功构建了一个库容量为5.6×10<5>,重组率为100％,重组子为600bp--2000bp大小的的蒿属花粉cDNA文库,该文库具有良好的质量,适合进一步筛选、克隆蒿属花粉变应原特异性基因,为进一步开展蒿属花粉重组变应原的研究奠定了工作基础.
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