CD9是tetraspanin家族成员之一，又称为运动相关蛋白(motility-relatedprotein)，是一24-27kDa细胞表面糖蛋白。参与细胞多种生物学功能，例如细胞的粘附、增殖、迁移及分化等。临床研究表明，CD9有抑制肿瘤细胞迁移的作用，在肺癌、乳腺癌及结肠癌，CD9表达量的减少与病情的恶化呈正相关。胚胎植入与肿瘤细胞侵入有着惊人的相似性，目前在雌性生殖方面，仅报道了CD9在人月经周期子宫上皮、牛子宫内膜及小鼠胚泡上的表达情况，而CD9在胚胎植入方面的功能性研究尚未见报道。为此，本研究利用间接免疫荧光、宫角注射、小鼠胚泡与子宫上皮细胞共培养等方法系统探讨了CD9在小鼠围植入期子宫、输卵管及卵巢上和动情周期子宫及植入前胚胎上的表达、CD9对胚胎植入的调节及其作用机理。 研究结果显示，在围植入期小鼠子宫中，CD9表达于基质、腺上皮及腔上皮，其表达模式是从子宫基质逐渐向腔上皮转移，在D4.5子宫含量达到峰值，提示CD9可能与胚胎植入有关。利用去卵巢模型发现E2及P4均上调子宫CD9的表达，与CD9在动情周期子宫的表达相似，但E2及P4对CD9在子宫中的分布没明显影响。RU486研究结果发现P4的调节作用不受P4受体介导。另外CD9强烈表达于输卵管腔上皮细胞、膜黄体细胞及卵泡的膜细胞，其作用可能与排卵及卵泡的成熟有关。在植入前的小鼠胚胎上，CD9特异表达于内细胞团及胚胎滋养层细胞，宫角注射的结果显示CD9抗体可以显著促进小鼠胚胎植入数。进一步研究发现CD9抗体及反义寡核苷酸(AS-CD9)均可促进小鼠胚胎在子宫上皮单层的扩展率、扩展面积及胚胎在FN上分泌MMP-2，提示CD9是通过调节胚胎的侵入能力来调控胚胎植入。利用多种信号通路的抑制剂进行阻断实验，发现其调节作用是通过PI3K介导的。胚胎侵入过程涉及大量细胞因子及信号分子，本研究的结果显示CD9抗体及AS-CD9均可上调活性β-catenin、环氧化物酶-2(COX-2)及VEGF的表达，而这种调节作用是主要通过Wnt1信号分子介导的。 综上所述，在小鼠胚胎植入的过程中，CD9在子宫及胚胎上均有特异表达，且呈不同分布模式，同时还受到雌、孕激素的双重调节。CD9对胚胎植入的调节作用是通过改变其扩展能力来实现的，并证实有MMP-2、活性β-catenin、COX-2及VEGF的参与。 第一章TetraspaninCD9在小鼠围植入期子宫、输卵管及卵巢上的表达及激素调节 摘要：TetraspaninCD9又称运动相关蛋白(MRP,motility-relatedprotein)。在人月经周期子宫腺上皮及牛子宫腔上皮细胞的顶端部位有特异表达，但在小鼠围植入期的子宫及卵巢中的表达模式尚不清楚。本研究利用激光共聚焦扫描、Westernblotting及real-timePCR等方法检测了小鼠围植入期子宫CD9蛋白表达、mRNA水平的变化以及围植入期输卵管和卵巢CD9的分布。结果显示：D1.5CD9表达于小鼠子宫基质细胞及腺上皮细胞，腔上皮细胞没有表达；D2.5时，CD9逐渐向子宫腔上皮细胞转移，部分腔上皮细胞内侧开始表达；D4.5时，CD9集中表达于子宫腔上皮细胞，而基质细胞及腺上皮细胞表达较弱，蛋白及mRNA的表达量达到峰值；D5.5-D8.5，CD9主要表达于母胎界面处，在基质细胞及腺上皮细胞表达较弱。以上结果提示，CD9可能参与胚胎植入的过程。 CD9在小鼠动情周期子宫中的分布无明显的变化，CD9主要在子宫腔上皮细胞及腺上皮细胞表达，Westernblotting结果显示从间情期至动情期CD9表达量是逐步升高的过程，动情后期降低。采用小鼠的去卵巢模型结果显示E2及P4对CD9的分布没有影响，但均上调了CD9蛋白及mRNA的表达量。E2及P4的效应是从2小时开始上调CD9，12小时表达水平达到峰值，24小时又降低。 输卵管是胚胎早期发育的场所，卵巢是维持妊娠的关键器官，我们的研究结果显示在围植入期D1.5-D6.5，CD9强烈表达于输卵管腔上皮细胞、膜黄体细胞及卵泡的膜细胞；D1.5-D5.5CD9在输卵管基膜表达较弱，而D6.5时CD9表达增加。 第二章TetraspaninCD9对小鼠胚胎植入的调节 摘要：已有研究表明CD9蛋白在人和牛的子宫内膜上皮细胞中强烈表达，在小鼠的卵子及囊胚上也有特异表达，这些结果提示CD9在胚胎植入过程中可能发挥调节作用，但其作用方式及作用机理目前尚不清楚。本研究采用CD9的单克隆抗体(monoclonalantibodyagainstCD9protein，anti-CD9mAb)及特异的反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotideagainstCD9，AS-CD9)分析CD9在小鼠胚胎植入过程中的作用及机理。结果显示，在妊娠小鼠D4子宫角注射CD9抗体可以显著提高小鼠胚胎的着床数(实验组7.24±0.39)vs(对照组4.04±0.38)。在体外，利用小鼠胚胎与子宫上皮细胞单层共培养模型研究显示，anti-CD9mAb及AS-CD9可以显著促进小鼠胚胎在子宫上皮细胞单层上的扩展，但对其粘附没有影响。基质金属蛋白酶(MMPs)是胚胎植入的关键分子之一，其中MMP-2是胚胎分泌的主要基质金属蛋白酶，anti-CD9mAb及AS-CD9可以刺激胚胎在纤粘链蛋白(FN)上分泌MMP-2。为了进一步探讨CD9在胚胎植入中所涉及的信号通路，本研究在胚泡体外培养实验中分别加入多种信号通路的特异的抑制剂，结果显示，磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)的特异抑制剂(LY294002)可以拮抗anti-CD9mAb及AS-CD9对胚胎扩展及MMP-2分泌的作用。以上结果提示CD9通过PI3K信号通路调节胚胎的侵入能力及MMP-2的分泌。 第三章CD9对妊娠小鼠子宫β-catenin、COX-2及VEGF的调节作用 摘要：CD9又称为运动相关蛋白，在细胞的运动、增殖、分化及胚泡的扩展中起着重要的调节作用。目前对CD9的调节机理尚不清楚。本实验利用宫角注射CD9抗体或反义寡核苷酸(AS-CD9)研究CD9对围植入期小鼠子宫β-catenin、COX-2及VEGF的调节。结果显示，CD9抗体或AS-CD9均促进了活性β-catenin、COX-2及VEGF的表达，而对总β-catenin无明显影响。Wnt信号通路在胚胎植入过程中发挥着重要作用，而β-catenin、COX-2及VEGF又是Wnt的靶分子。本实验的进一步研究结果显示，CD9抗体或AS-CD9均可促进wnt1及wnt3a的表达，而对wnt5a、mDKK-1及kremen-1的调节作用不明显。利用同侧子宫角共注射CD9抗体或AS-CD9和Wnt抗体或Wnt反义寡核苷酸，westernblot检测结果显示只有Wnt1反义寡核苷酸可以抑制CD9抗体或AS-CD9对活性β-catenin、COX-2及VEGF的调节，Wnt3a抗体的拮抗作用不明显。这些结果表明CD9通过Wnt1信号通路调节活性β-catenin、COX-2及VEGF的表达。