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研究目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是继阿尔兹海默病(Alzheimer disease,AD)世界第二常见神经退行性疾病,且患病率逐年上升。研究表明,长期接触农药等环境毒物能促进PD的发生发展。除草剂百草枯(paraquat,PQ)和杀真菌剂代森锰(maneb,Mb)是农业生产中常用的农药。大量研究显示,PQ和Mb联合暴露能显著增加PD的发病风险。PQ可穿过血脑屏障损伤黑质纹状体多巴胺能(dopaminergic,DA)神经元。与PQ类似,Mb暴露也导致DA神经变性,并且与PQ联合暴露能产生协同DA神经毒性。PQ和Mb联合应用已成为制备PD模型的常用方法。近些年来研究发现,PD发病不仅仅与DA神经元受损相关,还与脑干蓝斑核(locus coeruleus,LC)去甲肾上腺素神经元(noradrenergic neuron,NE)受损有密切联系。研究显示,在PD病变过程中,LC/NE神经变性程度甚至比DA神经元严重,出现时间也更早。但是,PQ和Mb联合暴露能否导致LC/NE神经受损目前尚不清楚。小胶质细胞活化介导的神经炎症反应与PD等多种神经退行性疾病发病密切相关。研究表明,活化的小胶质细胞可分为M1和M2两种极化类型。M1属于经典激活型,能产生大量促炎因子和活性氧(reactive oxygen species,ROS)等神经毒物,促进神经系统损伤。M2是选择性激活型,主要分泌抗炎因子。课题组前期在原代细胞培养中发现,PQ和Mb联合暴露能激活小胶质细胞。但是,PQ和Mb诱导小胶质细胞活化的类型是什么?PQ和Mb能否通过诱导小胶质细胞活化损伤LC/NE神经元?阻断小胶质细胞活化能否减轻PQ和Mb诱导的LC/NE神经损伤?均未见报道。因此,本研究通过PQ和Mb联合染毒建立小鼠PD模型,观察PQ和Mb联合暴露对LC/NE神经元的毒性作用;研究PQ和Mb联合暴露对LC脑区小胶质细胞活化和极化类型的影响及机制;同时探讨牛磺酸(Taurine,Tau)对PQ和Mb诱导小胶质细胞活化和LC/NE神经损伤的抑制作用,为PQ和Mb联合暴露损伤LC/NE神经元的分子机制和治疗研究提供参考依据。材料和方法:(1)PQ和Mb染毒模型:40只成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠,适应性喂养7天后,按体重随机分为对照组(Con)和染毒组(PQ+Mb),每组20只。PQ和Mb分别按照10 mg/kg·bw和30 mg/kg·bw经腹腔注射染毒,2次/周,连续6周。对照组给予相同剂量生理盐水。染毒结束后,麻醉小鼠(n=5只/组),经4%多聚甲醛灌注10分钟,取大脑组织用于病理切片观察。其余小鼠(n=15只/组)经生理盐水灌注心脏后,冰上迅速剥离大脑并分离脑干,放入液氮速冻后转入-80℃保存备用。(2)Tau保护模型:60只成年SPF级雄性C57BL/6J小鼠,适应性喂养7天后,按体重随机分为对照组(Con)、染毒组(PQ+Mb)和Tau保护组(Tau+PQ+Mb)。PQ和Mb染毒方法同上。Tau(150mg/kg)在PQ和Mb染毒前30分钟通过腹腔注射给予小鼠,2次/周,连续6周。染毒结束后,麻醉小鼠(n=5只/组),经4%多聚甲醛灌注10分钟,取大脑组织用于病理切片观察。其余小鼠(n=15只/组)经生理盐水灌注心脏后,冰上迅速剥离大脑并分离出脑干,放入液氮速冻后转入-80℃保存备用。(3)免疫组化分析:制备大脑冰冻切片,利用anti-TH(LC/NE神经元标记物)抗体进行免疫组化染色,观察LC/NE神经元数量;利用anti-Iba-1和anti-CD11b(小胶质细胞标记物)抗体进行免疫组化染色,观察小胶质细胞的活化水平。(4)qRT-PCR检测:小胶质细胞M1(iNOS、TNF-α、IL-1β)和M2(Arg-1、Ym-1)极化标记物的mRNA水平。(5)Western blot检测:脑干组织α-syn的表达和聚集水平以及JAK-STATs和NF-κB信号通路的活化水平。结果:第一部分小胶质细胞极化在PQ和Mb损伤LC/NE神经元中的作用(1)PQ和Mb联合暴露对小鼠体重的影响:小鼠在PQ+Mb染毒后体重增加略低于Con组,但与Con组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)PQ和Mb联合暴露对小鼠LC/NE神经元的影响:免疫组化结果显示,与Con组进行对比,PQ+Mb组小鼠脑干LC/NE神经元(TH~+细胞)数量从染毒第2周起有下降趋势(P>0.05),4周时显著降低(P<0.05),染毒后6周降低至Con组的41.5%(P<0.01);Western blot实验结果显示,与Con组相比,小鼠脑干α-syn单体的表达水平在PQ+Mb染毒6周后轻度增加(P<0.05),但寡聚体α-syn的表达水平明显增高(P<0.05)。(3)PQ和Mb联合暴露对小鼠脑干小胶质细胞活化和M1极化的影响:免疫组化结果显示,与Con组相比,PQ+Mb组小鼠在染毒2、4和6周后可观察到随着时间延长脑干小胶质细胞胞体增大、数量增多,Iba-1和CD11b染色光密度增加以及M1极化标记物iNOS和TNF-α的mRNA水平上调(P<0.05),说明PQ+Mb诱导小胶质细胞持续活化,并发生M1极化,且其发生时间早于LC/NE神经损伤。(4)PQ和Mb联合暴露对小鼠脑干JAK-STATs和NF-κB信号通路的影响:与Con组相比,小鼠经PQ+Mb染毒6周后,脑干p-STAT1、p-STAT3、p-p65和p-IκBα的蛋白表达水平明显增高,总IκBα的表达水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。第二部分Tau通过抑制小胶质细胞M1极化对PQ和Mb损伤LC/NE神经元的保护作用(1)Tau对PQ和Mb联合暴露小鼠体重的影响:与Con组相比,PQ+Mb染毒组、Tau保护组小鼠体重均无统计学差异(P>0.05)。(2)Tau对PQ和Mb联合暴露小鼠小胶质细胞活化和极化的影响:与Con组相比,PQ+Mb组Iba-1和CD11b染色光密度明显增大,小鼠脑干小胶质细胞活化;Tau治疗后明显减轻了PQ+Mb诱导的小胶质细胞活化,Iba-1和CD11b染色光密度显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。与Con组相比,PQ+Mb染毒后明显上调小鼠脑干M1标记物iNOS,TNF-α和IL-1β的mRNA水平(P<0.05);Tau治疗后明显减轻了PQ+Mb诱导的iNOS,TNF-α和IL-1β的mRNA含量,与PQ+Mb组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。PQ+Mb组小鼠脑干M2标记物Arg-1和Ym-1的mRNA水平较Con组也明显升高(P<0.05),但Tau对PQ+Mb诱导的M2标记物mRNA水平并无影响(P>0.05)。(3)Tau对PQ和Mb联合暴露的小鼠脑干JAK-STATs和NF-κB信号通路激活的影响:与Con组相比,PQ+Mb组小鼠脑干STAT1、STAT3和NF-κB信号明显活化(P<0.05);Tau治疗后明显减轻了PQ+Mb诱导的NF-κB活化(P<0.05),但并不影响STAT1和STAT3活化(P>0.05)。(4)Tau对PQ+Mb联合暴露诱导LC/NE神经退变和α-syn表达的影响:与Con组相比,PQ+Mb组小鼠LC/NE神经元(TH~+细胞)数量明显减少(P<0.01);Tau治疗后明显减轻了PQ+Mb诱导的LC/NE神经元数量减少,与PQ+Mb组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。与Con组相比,PQ+Mb组小鼠脑干α-syn寡聚体的表达水平显著升高(P<0.01);Tau治疗后明显减轻了PQ+Mb诱导的α-syn寡聚体表达增加,与PQ+Mb组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1、PQ和Mb联合暴露诱导小鼠LC/NE神经元受损。2、PQ和Mb联合暴露诱导小胶质细胞活化和M1极化,并且其发生时间明显早于LC/NE神经元损伤。3、PQ和Mb联合暴露诱导小胶质细胞M1极化可能与激活JAK-STATs和NF-κB信号通路有关。4、Tau拮抗了PQ和Mb诱导的LC/NE神经损伤和脑干α-syn聚集。5、Tau保护LC/NE神经元可能与抑制PQ+Mb诱导的小胶质细胞M1极化有关。6、Tau可能通过减弱PQ和Mb诱导的NF-κB信号通路激活来抑制小胶质细胞M1极化。