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杨树是林木中的模式树种,溃疡病是杨树的一种重要病害之一,在杨树的生长发育过程中,常常会受到多种病害和虫害的威胁,影响杨树的重要的经济价值。利用抗溃疡病的杨树品种是控制杨树溃疡病的最佳途径。由于对抗该病品种的抗病基因知之甚少,这样为应用抗溃疡病品种来控制溃疡病的发生,带来了巨大的困难。因此,随着分子生物学、遗传学、基因组学和生物信息学的飞速发展,给从分子水平上了解杨树抗溃疡病的抗病机理提供了坚实的技术基础,为了解抗溃疡病的基因表达及寻求新的抗病基因提够了理论基础和技术支持,对于获得稳定的、持久的抗溃疡病品种具有重要的理论与实践意义。 本研究运用抑制差减杂交(SSH)技术构建cDNA文库及EST技术,并结合生物信息学技术,对毛白杨抗溃疡病相关基因的表达进行分析,从转录水平来研究其抗病机制。以杨树抗溃疡病品种毛白杨(Populus tomentosa Carr)为实验材料,展开了对毛白杨抗溃疡病相关基因的表达研究,为今后杨树抗溃疡病的遗传育种等研究奠定了理论基础。主要内容包括:构建毛白杨被溃疡病菌侵染72 h后的SSH-cDNA库;从库中获得ESTs;将ESTs注释到Unisequences;挑选出毛白杨与溃疡病菌互作过程中上调的Unisequences;利用RT-qPCR对上调基因做进一步的分析。通过上述研究得到以下结论: (1)本研究构建了毛白杨接种溃疡病菌72 h的SSH-cDNA文库,对杨树溃疡病相关基因差异表达进行研究。从597个阳性克隆中随机挑选199个进行测序,测序结果经与NCBI基因库中序列进行比较,172个EST找到了同源序列,并对这些EST在dbEST数据库进行同源检索分析,将其分为13个功能类,分别是信号转导(27.5%)、能量(14.8%)、未知功能(9.0%)、病程防御基因(16.4%)、蛋白合成(0.5%)、转录相关(5.3%)、运输(1.1%)、激素代谢(4.8%)、与辅因子结合(3.7%)、预测蛋白(10.6%)、抗菌肽(0.5%)、其它压力蛋白(1.6%)和与防御无关的EST(4.2%)。 (2)利用实时定量PCR(qRT-PCR),对14个防御相关基因(GAPDH、NADkinase、ATP synthase CFO A subunit、Digalactosyldiacylglycerol synthase2、CONSTANS-like protein、WRKY21、Kunitz trypsin inhibitor TI3(KTI3)、P450 like proteinprecursor、 Cysteine proteinase inhibitor、 Senescence-associated protein、 Actindepolymerizing factor7(ADF7)、Zinc finger protein(Cys/His-rich)、Beta-glucosidase(Bgl)和Calmodulin binding进行六个时间点(12h、24 h、48 h、72 h、96 h和144 h)的研究,结果表明,这14个EST序列在溃疡病菌侵染后不同时间段内基因表达量是变化的,是与抗病相关的基因。