原发性肝癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，且发病率仍逐年增长，病人生存率、转移和复发率无明显改善。随着肿瘤生物治疗技术的不断发展，基因治疗作为肝癌生物治疗的一个重要手段越来越受到重视。但肝癌大多发生在肝硬化基础之上，基因治疗所引起的细胞毒性作用往往会影响到病人肝脏功能的恢复，所以基因治疗的靶向性对于肝癌病人来说尤为重要。甲胎蛋白(AFP)是伴随肝肿瘤存在的一种蛋白质标记，大约70％的肝癌病人体内都会有AFP升高，使用AFP启动子/增强子，将目的基因置于AFP转录调控元件下，可使目的基因在肝癌细胞中特异性表达。 基因转运需要合适的载体，理想的基因转运系统，应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。壳聚糖(CS)是一种天然聚多糖，有良好的生物相容性和生物可降解性。研究表明，壳聚糖是一种良好的基因载体，且可通过修饰改性增加其靶向性和缓释性。我们通过接枝共聚的方法将亲水无毒的聚乙二醇(PEG)链段引入壳聚糖链段中以增加其水溶性和缓释性；另外肝实质细胞膜上存在有去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，能专一性识别含有半乳糖或乙酰氨基半乳糖的糖蛋白等化合物，为了使DNA的传送具有专一性，将壳聚糖与乳糖共价连接，使之通过受体介导特异性进入肝细胞，达到主动肝靶向的目的。因此半乳糖化的壳聚糖.聚乙二醇纳米粒可作为靶向肝脏的潜在安全的基因载体。 Survivin是一种细胞凋亡抑制因子，Survivin蛋白在70％肝癌中呈强阳性，且Survivin的表达在肝癌组织与癌旁肝组织及正常组织间存在明显差异。Survivin对细胞凋亡的抑制及其在肿瘤细胞中表达的特异性，使得以Survivin为靶点治疗恶性肿瘤的设想成为近年来研究的新热点。 RNA干扰技术(RNAi)是近年来发展起来的新技术，RNAi引发的基因沉默作用是特异的和有效的，具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点，为肿瘤的基因治疗提供新的、有前途的手段。是当前基因治疗研究最广为应用的基因沉默工具。 基于以上目的和已有的研究成果，利用已证实的AFP增强子可调控目的基因在AFP阳性的肝癌细胞中特异性表达的特点，我们构建了AFP增强子调控的Survivin基因shRNA的联合质粒载体，并制备了乳糖化的壳聚糖-聚乙二醇纳米粒(LA-CS-PEG)，用纳米载体包裹目的基因，利用基因和纳米粒的双重靶向，携带shRNA选择性作用于Survivin阳性的肝癌细胞，然后利用shRNA高效的基因沉默功能，促进肿瘤细胞凋亡，为肝癌的基因靶向治疗提供了一种新方法，实现低毒性、高效率、大容量及基因治疗的特异性，有效解决了基因治疗中靶向性差的问题，为肝癌的基因治疗开拓了新途径。本研究分作三部分加以论述。 第一部分是构建AFP增强子介导的survivin shRNA融合质粒。先自AFP阳性的HepG2细胞中抽提出AFP增强子核心片段约450bp，通过PCR扩增、Xbal和EcoR I双酶切、链接构建AFP增强子荧光素酶质粒载体(pGenesil-AFP)；设计、合成survivin shRNA，然后用BarmHI和Hind Ⅲ酶切、链接至改建的质粒载体的合适位置，构建AFP增强子介导的survivin shRNA质粒载体；最后通过酶切电泳、基因测序证实正确构建了所需的目的基因。 第二部分是制备纳米基因复合物。先合成活化的单甲氧基聚乙二醇5000，再通过接枝共聚合成水溶性的壳聚糖-聚乙二醇，最后连接上乳糖酸(LA)得到乳糖化的壳聚糖-聚乙二醇纳米粒，通过检测纳米粒形态、粒径、Zeta电位考察纳米粒的理化特性及MTT考察细胞毒性；采用复凝聚法制备载基因纳米粒复合物(DNA-NP)，用不同的基因/纳米粒比例优化处方。最后制得的空纳米粒粒径为92.5±18.6nm，Zeta电位为39.4±4.2mv，细胞毒性较脂质体弱，且随剂量加大增加不明显；基因/纳米(w/w)为1:5的条件下制备的基因-纳米复合物粒径为151.4±18.5nm，Zeta电位为12.2±3.3mV，包封率为75.6±10.2％，载药量为30.2±5.8％，且对基因有很好的保护作用，选用此条件下制得的基因.纳米复合物进行基因转染实验。 第三部分是通过体外细胞实验考察基因-纳米复合物的转染效果、靶向性和缓释性。通过转染survivin高表达的AFP阳性、阴性的肝肿瘤细胞系及非肝来源的肿瘤细胞系，检测绿色荧光蛋白的表达量、survivin mRNA及蛋白下降水平，并与脂质体和裸基因转染相比较考察基因.纳米复合物体外转染的靶向性和缓释性；通过流式细胞术及荧光显微镜的形态学观察考察基因.纳米复合物的体外基因治疗作用。结果显示复合物对肝肿瘤细胞有良好的靶向性和缓释性，其中对AFP阳性的肝肿瘤细胞靶向性最强(P<0.01)；纳米粒和AFP增强子介导的针对survivin基因的shRNA能明显促进HepG2细胞的凋亡，与裸基因比较有显著性差异(P<0.01)。 本研究证实，我们成功地制备了包裹目的DNA的基因纳米复合物，且制备的复合物具有双重靶向性，即AFP增强子的靶向性调控、纳米载体的靶向性释放，能选择性地增加对AFP阳性、survivin阳性的肝肿瘤细胞的转染效果和对survivin mRNA和蛋白质的抑制作用，从而达到靶向治疗肝肿瘤的目的。