菊芋果聚糖合成酶基因克隆与表达分析

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菊芋(Helianthus tuberosusL.),属菊科向日葵属,又名洋姜、鬼子姜,是一种多年宿根性草本植物,菊芋高1-3米,有块状的地下茎及纤维状根。菊芋抗逆性好,果聚糖含量高。因此从菊芋中发掘果聚糖合成酶基因以及对其功能的分析对菊芋的耐旱机理研究和耐旱遗传改良具有重要意义。本实验以菊芋品种“青芋1号”为材料,分别克隆了果聚糖合成酶基因1-SST和1-FFT,通过实时荧光定量PCR对这两个基因在不同程度干旱胁迫处理下的表达进行研究,并对1-SST和1-FFT进行原核表达,为下一步的转基因奠定了基础。具体结果如下:  1-SST基因CDS长1985bp,编码659个氨基酸,分子量为74.59kD,等电点为5.10,蛋白质半衰期为7.2小时,为稳定性蛋白,总平均亲水性为-0.171,属于亲水性蛋白。序列同源性比对表明,菊芋1-SST与朝鲜蓟、莴苣和菜蓟等菊科作物的同源性分别为84%、83%、83%。进化树分析结果表明菊芋1-SST与朝鲜蓟1-SST遗传距离最近。  1-FFT基因CDS长2025bp,编码641个氨基酸,分子量为73.802kD,等电点为10.01,不稳定系数为46.08,属于不稳定蛋白,总平均亲水性为-0.153表明1-FFT蛋白属于亲水性蛋白。序列同源性比对表明表明,菊芋1-FFT与维氏菊的同源性最高,为85%,进化树分析显示菊芋1-FFT与维氏菊1-FFT遗传距离最近。  实时荧光定量PCR结果显示:1-SST和1-FFT在菊芋叶片、茎段、根、花及块茎中均有表达,但在不同组织中的表达水平有显著差异,1-SST和1-FFT基因在块茎中的表达量最高。利用PEG6000模拟胁迫,结果表明,1-SST基因和在1-FFT基因不同胁迫时间均有表达,并存在显著性差异,其中1-SST基因在48h时表达量最高,1-FFT基因在60h时表达量最高。  以pET30a为原核表达载体,分别与1-SST和1-FFT基因重组构建了融合表达载体,转入大肠杆菌,进行诱导融合蛋白表达,结果表明1-SST和1-FFT均能在原核表达体系中正常表达。
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