蛋白酶抑制剂广泛分布于自然界中，以不同形式存在于植物，动物及微生物体内，是一类可以作用于蛋白酶，并对酶有特异性抑制作用的小分子物质或蛋白质。它们按一定比例与酶结合形成可逆的蛋白质复合物，在血液凝固，补体级联反应，细胞凋亡的调控以及激素加工处理等过程中发挥重要的作用。荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat Trypsin Inhibitor, BTI)是由69个氨基酸组成的分子量为7.9kD的耐热小分子蛋白，属于PotatoⅠ型蛋白酶抑制剂家族。本课题组的前期研究表明，重组的荞麦胰蛋白酶抑制剂(recombinant Buckwheat Trypsin Inhibitor,rBTI)，对Hep G2，EC9706，K562，HL60等肿瘤细胞株都有明显的抑制生长并诱导其凋亡的作用，而对正常肝细胞HL7702没有影响;rBTI可以诱导促凋亡基因表达上调，抗凋亡基因表达下降，可以使EC9706细胞周期阻滞于G0/G1期，但是具体的分子机制还不清楚。　　本研究选用pExSecⅠ表达载体，构建了含有BTI基因的表达质粒pExSecI-BTI，经原核表达和纯化，获得了无融合标签的rBTI，分析了rBTI内化进入Hep G2细胞的机制，探讨了其诱导Hep G2细胞自噬的分子机制，以及与细胞表面的可能受体uPA的相互作用。主要结果如下:　　1.构建了原核表达载体pExSecⅠ-BTI，并对其表达条件进行了优化，当诱导剂IPTG的浓度为0.5mmol/L，诱导时间为3.5h时，rBTI的表达量最高。根据rBTI热稳定性好的特点，对rBTI的纯化条件进行了优化（80℃热处理20min），经ResourceTMQ离子交换层析一步纯化即可获得纯度大于95％的rBTI。这一纯化步骤应用于rBTI的大规模制备亦十分有效。　　2.将rBTI用FITC标记，综合运用多种内吞抑制剂及方法，如NH4Cl，MDC，K+，蔗糖溶液等，以及RNA干扰，M期阻滞等技术和激光共聚焦显微镜研究了rBTI进入Hep G2细胞的方式。提出rBTI以细胞膜上尿激酶型纤溶酶原激活子(uPA)为受体，通过网格蛋白依赖性的内吞作用进入细胞，呈现浓度和能量依赖性，其中细胞膜电位在内吞过程中起着重要作用。　　3.采用透射电子显微镜，MDC染色，流式细胞术等技术研究了rBTI诱导的Hep G2细胞自噬。rBTI作用Hep G2细胞后，透射电子显微镜观察到细胞内部出现自噬体以及自噬溶酶体结构，细胞发生了自噬，细胞的自噬活性与rBTI的浓度呈正相关。通过MDC染色以及pCMV-GFP-LC3转染实验，进一步确定了rBTI可以诱导细胞产生自噬，当rBTI诱导4h后，Hep G2细胞即发生明显的自噬现象。应用激光共聚焦显微镜观察了rBTI作用前后胞内细胞器的变化。在rBTI作用12h后，Hep G2细胞内质网和溶酶体发生较大的变化，线粒体膜的通透性发生改变，但是细胞核的变化不明显。通过自噬抑制剂3-MA的联合使用以及细胞恢复实验等方法，明确了rBTI诱导的细胞死亡主要是自噬性程序性细胞死亡。　　4.构建了pEGFP-N1-BTI单色荧光载体及pDsRed1-N1-EGFP-BTI双色荧光载体，观察了rBTI在Hep G2细胞内的定位，确定了rBTI主要定位于胞质中的自噬体及自噬溶酶体。据此我们提出假说:作为外源物的rBTI被细胞内的自噬相关分子选择性识别，进入自噬溶酶体被降解，过度的自噬诱发细胞失去固有的稳态，进而走向死亡。即rBTI介导的细胞死亡是一种底物特异性的死亡机制。通过RT-PCR的方法，对rBTI作用后三个自噬相关分子（mTOR，Beclin1和PI3KⅢ）进行了RNA水平的分析，结合3-MA抑制剂实验，初步确定rBTI诱导的细胞自噬主要受Beclin1复合物的调控。　　5.通过荧光光谱法、凝胶电泳法等，进一步确定了rBTI与uPA之间存在相互作用。在体外条件下，rBTI可作为uPA的底物，被uPA水解为两个片段。采用RT-PCR的方法，对rBTI作用后，uPA以及uPA下游两个分子（MMP-2和MMP-9）进行了检测，并通过明胶酶谱和细胞划痕实验研究了rBTI对Hep G2细胞迁移的影响。结果表明，rBTI可以诱导uPA，MMP-2和MMP-9的表达，并促进Hep G2细胞迁移。