环糊精（Cyclodextrins,CDs）是指由6个及以上葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键首尾相连形成的低聚糖化合物。常见的CD中,γ-CD因具有空腔大、溶解性好、安全性高的特质,在食品、医药、生物等领域应用前景广阔,其主要利用γ-环糊精葡萄糖基转移酶（γ-Cyclodextrin Glycosyltransferase,γ-CGTase）的环化活力转化淀粉而生成。目前,已报道的γ-CGTase存在种类较少且热稳定性差的问题,无法满足淀粉底物糊化状态下的催化需求,因此发掘新型γ-CGTase并提高其热稳定性对推动γ-CD生产具有重要的现实意义。本课题以来源于Bacillus sp.FJAT-44876的γ-CGTase为研究对象,探究了其酶学性质,并通过Ca²⁺及定点突变进一步提高其热稳定性,旨在为γ-CGTase热稳定性基础研究提供参考和γ-CD生产提供新的选择。通过序列比对、克隆表达、分离纯化,得到一个具有高热稳定性潜质的新型γ-CGTase并对其进行酶学性质研究。将其克隆表达后,利用镍亲和层析进行分离纯化以及SDS-PAGE进一步验证。结果显示,电泳图谱中仅有单一条带,已达到电泳纯,且其相对分子量约为80 kDa。液相色谱（HPLC）及超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）结果表明,反应初期的主产物为γ-CD,且无α-CD生成,进一步确定该酶为γ-CGTase。该酶最适温度为50°C,且50°C下酶的半衰期(t_1/2)为9 h,热稳定性较好;最适pH为10.0,且在pH 6.0～11.0范围内具有良好的稳定性;Ca²⁺、Mg²⁺可促进酶活,Na⁺几乎不改变酶活,K⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、EDTA对酶活产生抑制,其中Fe²⁺和Mn²⁺的抑制作用显著;甲醇、乙醇、环己烷、十二醇可轻微促进酶活,而异丙醇与正丁醇使酶活略有降低。系统探究了不同浓度Ca²⁺对γ-CGTase酶活及热稳定性影响。5 mmol/L Ca²⁺对酶的激活程度最大,酶活提高了近15%;10 mmol/L Ca²⁺对热稳定性的提升效果最好,55°C的t_1/2由3.04 h延长至17.37 h,60°C下t_1/2从0.27 h增加到1.98 h。SWISS-MODEL构建的模型发现,A、B结构域之间存在的一个Ca²⁺结合位点,可能与重组酶热稳定性有关。结构分析表明,Ca²⁺的存在可稳定H252,进而稳定同一柔性环上活性中心的D248。内源荧光法与差示扫描微量热法探究Ca²⁺对酶结构稳定性的影响。结果表明,添加Ca²⁺后,可造成不同温度处理下酶最大波长的红移程度减弱,同时熔融温度（T_m）增大,说明Ca²⁺可有效保护γ-CGTase构象稳定及提高其热力学稳定性。此外,研究发现热稳定性提高的γ-CGTase有利于γ-CD的制备。为提高γ-CGTase热稳定性,引入定点突变手段,以β-CGTase中影响热稳定性的关键氨基酸为研究对象,通过序列比对确定208位甘氨酸（Gly）为突变位点,并分析突变体G208S的基本性质及热稳定性提升机理。鉴定G208S分子量约为80 kDa,最适温度为50°C,热稳定性得到提高,60°C下t_1/2为0.50 h,是野生型相同条件的1.85倍。结构分析推测,208位点处的丝氨酸（Ser）可分别与203位、204位Ser形成间接、直接氢键,进而促使酶结构稳定。圆二色光谱和荧光光谱结果显示,55°C、60°C保温后,突变体G208S的二级结构组成比例与野生型的变化程度相似,但突变体最大波长发生的红移现象减弱,表明突变体热稳定性的有效提高可能得益于三级结构的稳定,而非正确折叠的二级结构。