论文部分内容阅读
随着人类社会生产力的大幅提高及人口压力的不断增大,全球范围的淡水水体富营养化现象日趋严重,由此引起的蓝藻水华在世界范围内频繁爆发,伴随其产生的毒素与动物及人类健康的关系受到了越来越多的关注。微囊藻毒素(Microcystins,MC)就是一类出现频率高、产毒量大、危害严重的蓝藻毒素。由于鱼类是水生态系统的次级或顶级消费者,直接暴露于微囊藻毒素中,所以与此相关的鱼类死亡和鱼类中毒事件时有报道。而谷胱甘肽S-转移酶,即GST(glutathione S-transferase)在微囊藻毒素去毒过程起着很重要的作用,被称为是淡水鱼类去毒酶。但是,有关淡水鱼类GST的信息,我们还知之甚少,尤其是在它与微囊藻毒素的相互作用关系方面,因而本文扩增了鲫鱼(Carassius auratus)的三种GST基因核心序列,并通过腹腔注射不同剂量粗提物(200和50μgMC-LReq./kg bw)微囊藻粗提物后,检测三种GST基因转录的变化,并分析其可能因为。MCs除影响解毒酶表达外,还会影响细胞骨架结构。近几十年,微囊藻毒素或微囊藻粗提物引起的细胞或组织形态学改变已从微丝、微管及中间纤维三种组分角度有过详细的描述,可是定量的检测细胞骨架基因变化的研究还很少,并且,目前基于微囊藻毒素介导的微丝相关蛋白和微管相关蛋白表达的变化还是空白。为了了解微囊藻毒素介导的细胞骨架变化的分子机制,我们静脉注射wistar大鼠(剂量80μg MC-LReq./kg bw)后,在肝、肾、脾、睾丸四个器官中研究三个细胞骨架结构组分基因和三个微丝相关蛋白,三个微管相关蛋白基因的对毒素注射的响应。本实验室2009年运用抑制性差减杂交(SSH)研究微囊藻毒素-LR在鳙鱼(Aristichthys nobilis)肝脏中的致毒机制时发现,核糖体蛋白S6、S27a、L27、L29表达上调,L12、S12及S24表达下调,提示这几种核糖体蛋白可能与微囊藻毒素抗性或致毒机制相关,因而本研究采用RACE技术,从鳙鱼肝脏中克隆核糖体蛋白L12、L24、L27、L29、S6、S12和S24.基因cDNA全长,并在腹腔注射MC-LR(500μg MC-LR/kg bw)的鳙鱼肝脏、肾脏、前肠、心脏、脾脏、脑、鳃七个器官中验证这些基因的表达。
主要结果和结论如下:
1.本研究首次扩增了鲫鱼mu、kappa、rho三个亚族GST基因的核心序列,并利用荧光定量PCR技术,通过腹腔注射微囊藻粗提物(200和50μg MC-LReq./kg bw)研究了这3个基因分别在鲫鱼肝脏、肾脏和肠道转录的变化,研究发现:1)本研究获得的GST三亚族基因的核心片段与鲤鱼相应基因的亲缘关系最近；2)三个亚族基因转录变化在不同组织器官呈现不同的变化趋势,其原因可能是各基因在个组织器官中本底值不同,或各器官中微囊藻毒素含量不同造成的；3)本研究所得结果与其他研究人员所得结果并不完全一致,其原因可能是实验动物、染毒方式、毒素剂量及取样间隔不同所致；4)GST rho的转录在肝脏低剂量组、高剂量组除1 h外,肾脏肠道两个剂量组中转录被抑制,推测GST rho表达抑制可能是微囊藻毒素在鱼类中的毒性作用机制之
2.通过静脉注射微囊藻提取物(剂量80μg MC-LReq./kg bw)染毒,我们在大鼠肝、肾、脾及睾丸中中测定九种细胞骨架基因(actin,tubulin,vimentin,ezrin,radixin,moesin,MAP1b,tau,stathmin)的转录变化,发现MCs可以破坏这些基因的转录平衡,且肝脏中actin、ezrin、radixin和tau蛋白的转录与肝脏中毒素含量显著相关,肾脏中stathmin的转录与肾脏中毒素含量显著相关,脾脏和睾丸中radixin的转录分别与这两个器官中毒素含量显著相关。推测微囊藻毒素引起的细胞连接变宽或消失是通过影响ERM基因转录或者蛋白表达所致；几个与肿瘤发生(ERM家族,stathmin)相关基因的转录变化可以为MCs潜在的致癌威胁提供依据；MAP1b和tau蛋白的转录变化也为MCs脊椎动物神经系统的毒害作用提供了依据。
3.本研究根据已知的部分核糖体蛋白片段,克隆了鳙鱼7中核糖体蛋白的cDNA全长,并开展了基因序列分析、蛋白二级结构分析、蛋白氨基酸序列的同源性分析和蛋白系统进化等几个方面的分析。序列分析结果显示,本文克隆的鳙鱼7个核糖体蛋白基因与已知核糖体蛋白序列中斑马鱼的这些基因亲缘关系最近；二级结构分析认为核糖体蛋白L29、S6、S12和L12属于α-螺旋型核糖体蛋白,S27a和L27属于β-折叠型核糖体蛋白,S24属于α/β型核糖体蛋白；荧光定量PCR验证结果显示,肝脏中各核糖体蛋白基因的转录变化与文库筛选结果一致,但在其他器官中转录变化趋势与肝脏中并不相同,推测因为可能是由于各核糖体蛋白基因除最基本的参与蛋白质合成这一功能外,还具有其他功能,故其转录变化不一致。此外,鳙鱼各器官中毒素的含量也不同,毒素的含量也可能会影响这些基因的转录。