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研究背景:乳腺癌是世界3大癌症之一,是女性最常见的恶性肿瘤,高发病率地区可达每8-10位女性中就有1位罹患乳腺癌。癌细胞的无限增殖特性是乳腺癌一切恶性特征的生物学基础,而这一永生特性的维持需要多种分子生物学机制参与。ZEB1是一种E-box结合转录因子,参与多种癌基因表达的调控。以往对ZEB1的研究侧重于它对乳腺癌上皮间质转化的诱导以及对肿瘤迁移侵袭特性的调节。随着研究的深入,越来越多的证据显示ZEB1也参与肿瘤细胞增殖凋亡特性的调控。ZEB1在乳腺癌中参与细胞增殖调节鲜见报道,且具体的调控机制亦尚未阐明。研究目的:探究ZEB1在乳腺癌细胞中对细胞增殖凋亡的调节方式,验证ZEB1-hTERT这一通路是否在肿瘤细胞增殖调控中起到作用,以及探讨二者之间相互作用的具体分子机制。研究方法:对133例乳腺癌组织及癌旁组织提取物进行qRT-PCR检测ZEB1和hTERT在m RNA水平的表达,免疫组织化学检测乳腺癌组织中ZEB1和hTERT在蛋白水平的表达,验证二者之间的相关性。使用小干扰RNA技术在乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中人为降低ZEB1表达,或使用过表达质粒载体上调ZEB1的表达,qRT-PCR和western blot检测hTERT在转录和翻译水平的表达变化,验证ZEB1对hTERT的调控作用。升高或降低ZEB1表达后对端粒酶的活性和两种乳腺癌细胞中染色体末端端粒长度进行检测,研究ZEB1调控hTERT表达所产生的生物学效应。通过qRT-PCR和western blot检测验证ZEB1的上调能否抵消hTERT下调所引起的表达水平的下降,恢复hTERT在m RNA和蛋白水平的表达。MTT实验和流式细胞凋亡实验分别用于检测同时下调hTERT和上调ZEB1后MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖状态和凋亡状态与单独敲除hTERT后细胞状态的改变之间的差异。染色质免疫共沉淀及双荧光素酶报告基因检测用于分析ZEB1与hTERT启动子的结合情况。组织样本及细胞样本的DNA提取物进行碱基测序,用于检测hTERT启动子区域碱基突变情况。免疫共沉淀实验用于检测ZEB1和YAP的结合情况。染色质免疫共沉淀及双荧光素酶报告基因检测用于分析YAP与hTERT启动子的结合情况。构建启动子截断荧光素酶报告基因质粒,用于检测ZEB1和YAP的相互作用和探究二者在调控hTERT转录过程中的相互作用。qRT-PCR和western blot检测YAP的表达变化对hTERT的m RNA和蛋白表达水平的调控。裸鼠皮下异种移植物造模用于分析ZEB1在机体内对hTERT的调控作用。qRT-PCR和免疫组化用于检测异种移植物中ZEB1和hTERT表达水平之间的联系。研究结果:在乳腺癌组织中,ZEB1的表达和hTERT的表达在m RNA和蛋白水平呈明显正相关。在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中ZEB1对hTERT的表达有正向调控作用。ZEB1的过表达可以诱导端粒酶活性升高,维持端粒长度。ZEB1表达升高可以抵消si RNA引起的hTERT表达水平降低、细胞增殖减弱和细胞凋亡增多。分子作用机制研究结果显示,ZEB1可以与YAP形成转录蛋白复合体,在乳腺癌细胞中结合于hTERT启动子-1051—-957bp处,发挥促启动子转录活性作用。在裸鼠异种移植物模型中,ZEB1对hTERT表达的调控作用依然存在。研究结论:本研究首次证实了ZEB1-hTERT通路在乳腺癌细胞增殖调控中发挥作用。ZEB1可以募集共刺激因子YAP形成蛋白复合体,结合于hTERT启动区域促进hTERT转录活性,上调hTERT的表达,从而促进乳腺癌细胞的增殖,抑制细胞凋亡。以往的研究已证实ZEB1可参与乳腺癌EMT的诱导,调节肿瘤细胞的迁移侵袭特性,本研究证实ZEB1也参与调控肿瘤细胞的增殖凋亡,对ZEB1在乳腺癌发生发展中的调控作用进行了补充。这为ZEB1作为一个全面参与乳腺癌调控的分子,成为乳腺癌新的治疗靶点提供了理论依据。