论文部分内容阅读
目的：1探讨瞬时型感受器电位1、3（TRPC1、3）在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）钙敏感受体（CaR）介导钙离子(Ca2+)内流和一氧化氮（NO）生成的作用和机制。方法：（1）胰蛋白酶消化原代培养HUVEC，倒置显微镜下进行细胞形态学观察及免疫细胞化学法测Ⅷ因子对其进行抗原鉴定。（2）用钙池操纵的钙离子通道（SOC）阻滞剂和/或受体操纵钙离子通道（ROC）阻滞剂分别和/或联合孵育细胞，采用Western blotting技检测TRPC1和TRPC3蛋白的表达。（3）免疫细胞化学技术检测TRPC1、TRPC3蛋白表达及定位。（4）利用转染技术将构建的TRPC1RNA、TRPC3RNA干扰质粒（TRPC1shRNA、TRPC3shRNA）转染入HUVEC中，实时定量RT‐PCR和Western blotting检测TRPC1shRNA、TRPC3shRNA转染后的抑制效率。（5）取2～5代细胞随机分组：实验组(即精胺+Ca2++shTRPC1组和精胺+Ca2++shTRPC3‐004组)，其余两组分别为对照组(Control组，即精胺+Ca2+组)，空质粒组(Vehicle组，即精胺+Ca2++Vehicle组)，分别将上述4组细胞与CaR激动剂（SOC和ROC均激活）、ROC模拟剂TPA及CaR负性变构调节剂Calhex231（激活ROC、阻断SOC）、PKC抑制剂Ro31‐8220和经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6976（阻断ROC、激活SOC）孵育，各组用荧光探针DAF‐FM、Fura‐2/AM负载方法同步测定NO生成和[Ca2+]i的变化。（6）实验数据用均数±标准误表示，组间比较用单因素方差分析，均数间的比较采用t检验或卡方检验。所有数据采用SPSS17.0统计软件包进行分析，以p<0.05表示差异有统计学意义。结果：（1）细胞形态学与免疫细胞化学法测Ⅷ证实原代培养的细胞为HUVEC。（2） HUVEC经SOC阻滞剂和/或ROC阻滞剂分别和/或联合处理后，TRPC1和TRPC3蛋白的表达检测结果显示：各加药组与Control组(精胺+Ca2+组)相比，均无统计学意义（P>0.05）。（3）免疫细胞化学技术检测显示：TRPC1和TRPC3蛋白表达于胞浆，两者共定位于胞浆。（4） Westernng blotting检测结果显示：与Control组相比，shTRPC1和shTRPC3‐004干扰后，TRPC1和TRPC3蛋白的表达均降低（抑制率分别为83.4%和71.8%）（p<0.05），实时定量PCR检测结果显示：与Control组相比，shTRPC1和shTRPC3‐004干扰后，TRPC1和TRPC3mRNA的表达均降低（抑制率分别为39.0%和74.0%）（p<0.05）。（5）[Ca2+]i△ratio值和NO净荧光强度值的测定结果如下：与精胺+Ca2+组的[Ca2+]i （△ratio=7.54±0.18）、NO净荧光强度值（846.39±68.13）相比，精胺+Ca2++ShTRPC1组（△ratio=5.73±0.15）、（137.82±14.22）均明显降低（p<0.05）；而精胺+Ca2++Vehicle组（△ratio=7.66±0.13）、（724.96±20.72）；精胺+Ca2++ShTRPC3‐004组（△ratio=7.37±0.12）、（794.685±20.60）没有显著差异（p＞0.05）。与Calhex231+TPA+精胺+Ca2+组的[Ca2+]i（△ratio=4.64±0.07）、NO净荧光强度值（176.20±14.13）相比，Calhex231+TPA+精胺+Ca2++ShTRPC1组（△ratio=2.67±0.07）、（58.65±5.05）均明显降低（p<0.05）；而Calhex231+TPA+精胺+Ca2++Vehicle组（△ratio=4.43±0.14）、（175.31±16.89）；Calhex231+TPA+精胺+Ca2++ShTRPC3‐004组（△ratio=4.51±0.12）、（150.71±6.08）没有显著差异（p＞0.05）。与与Ro31‐8220+精胺+Ca2+组的[Ca2+]i （△ratio=6.03±0.05）、NO净荧光强度值（214.96±7.83）相比， Ro31‐8220+精胺+Ca2++ShTRPC1组（△ratio=3.41±0.09）、（57.97±7.14）均明显降低（p<0.05）；而Ro31‐8220+精胺+Ca2++Vehicle组（△ratio=5.90±0.03）、（207.34±10.2）； Ro31‐8220+精胺+Ca2++ShTRPC3‐004组（△ratio=5.90±0.07）、（192.52±19.21）没有显著差异（p＞0.05）。与Go6976+精胺+Ca2+组)的[Ca2+]i（△ratio=5.98±0.02）、NO净荧光强度值（199.16±6.93）相比，Go6976+精胺+Ca2++ShTRPC1组（△ratio=4.22±0.11）、（57.44±6.65）均明显降低（p<0.05）；Go6976+精胺+Ca2++Vehicle组（△ratio=6.03±0.13）、（199.92±12.19）； Go6976+精胺+Ca2++ShTRPC3‐004组（△ratio=6.15±0.15）、（187.5±1.5）没有显著差异（p＞0.05）。结论：（1）TRPC1在CaR介导Ca2+内流和NO生成中起着重要作用。（2） TRPC1为CaR经SOC和ROC介导Ca2+内流和NO生成的关键组件之一；TRPC3没有参与上述过程。