甜菊叶是一种天然、绿色、具有甜味和保健双重功能的优质资源,其叶片中糖苷类化合物的含量最高且种类最多,也还含有蛋白质、纤维素、脂肪、黄酮类及微量元素等各类功能物质。因此,甜菊叶的综合加工与利用研究非常重要。本文在乙醇辅助萃取制备甜菊甙的基础上,进一步研究甜菊叶中蛋白质、纤维素的酶解工艺和相关提取物的功能活性,以及采取实验室可行的方式进行酶的相关探讨研究,以期为甜菊叶的广泛开发利用提供一条绿色健康的综合加工新方式。首先运用乙醇和水的混合溶剂对甜菊甙进行提取制备和纯化处理,然后用响应面法优化浸提残渣中蛋白质和纤维素的提取工艺,并对甜菊叶各提取物的相关功能进行评价,最后对乙醇浸提残渣发酵产酶的技术及部分性质进行了初步研究,试验结果表明:1.对甜菊甙制备的过程中,首先按照国标等方式,对甜菊叶的主要组成成分进行了含量的测定,结果是:甜菊甙为13.83%±0.36%,水分为11.15%±0.05%,灰分为7.95%±0.39%,蛋白质为12.11%±0.21%,粗纤维为10.37%±0.18%。然后对甜菊叶片预处理,进行了乙醇和水的混合溶剂对甜菊甙的萃取制备与分离纯化的稳定性试验,即根据甜菊甙制备过程中的研磨目数、乙醇浓度、浸提时间、浸提温度及料液比等单因素试验,用IBM SPSS Statistics 25正交处理软件对各条件进行优化,得到:最佳研磨目数为300目,最佳乙醇浓度为60%,最佳浸提时间为60 min,最佳浸提温度为55℃,最佳料液比为1:12。再以最优工艺条件,进行3次平行纯化处理试验,得到甜菊甙的纯度为90.48%±0.65%。2.在蛋白酶提取乙醇浸提粉中蛋白质的试验中,以酶解的pH、料液比、酶解的温度、酶的浓度、酶解的时间及研磨的目数等因素对蛋白质提取率的影响进行工艺研究与分析后,根据Box-Behnken试验设计,使用Design-Expert.V8.0.6.1软件做响应面试验以进行相关因素的数据拟合,优化后的最佳工艺条件为:酶解的pH值是7.97、料液比是1:8.64、酶解的温度是53.12℃、酶的浓度是3.73%,软件通过相应的回归方程预测得到蛋白质的提取率为86.72%。为后续试验的方便验证,对优化工艺进行修正,即有:酶解的pH值为8.0,料液比为1:9,酶解的温度为53.1℃,酶的浓度为4%。此时,得到87.05%的蛋白质提取率,与理论预测值基本一致,可见模型是可靠的。另外,以相同的优化条件通过在制备得到的明胶溶液中分别添加甜菊甙与绿原酸,类比探究甜菊叶中具有抑制蛋白酶活性的成分,结果表明:蛋白质的提取率并不会因甜菊甙的存在而受影响,即甜菊甙对蛋白酶的活性无抑制作用,而绿原酸的存在则会明显抑制蛋白质提取率。这对后期进一步提高酶解效率,即提高甜菊叶蛋白质的提取率具有指导意义。在纤维素酶提取乙醇浸提粉中纤维素的试验中,经单因素分析和Design-Expert.V8.0.6.1软件处理,酶解条件优化为:料液比是1:13.73、酶的浓度是1.58%、酶解的时间是2.48 h、研磨的目数是283.48目。对此进行适当修正后,按照1:14的料液比、1.6%的酶浓度、2.5 h的酶解时间、300目的研磨目数试验,测得纤维素提取率达到74.88%,与软件的预测值73.32%相比,误差可忽略。3.对于甜菊叶蛋白的酶水解液、乙醇萃取物和纯甜菊甙样品溶液的ACE抑制活性的比较探讨中,发现三种溶液均表现出明显的抑制作用,且甜菊叶蛋白的酶水解液抑制活性是最强的。在对浓缩的甜菊叶蛋白水解样品的功能性质测定中,得到:甜菊叶蛋白酶解物的持水性为2.921g/g、持油性为2.262 g/g、起泡性及起泡稳定性分别为115.640%和65.333%、乳化性及乳化稳定性分别为51.956%和83.013%。对甜菊叶蛋白的酶水解物体外抗氧化性进行测定,结果表明:羟基自由基的清除活性明显强于超氧阴离子自由基的清除活性。且在甜菊叶蛋白酶解物的样品浓度增加到0.5 mg/ml时,羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除活性也分别达到了最大值,即68.25%和44.24%,表明甜菊叶蛋白的酶水解物具有一定的体外抗氧化性。4.甜菊叶乙醇浸提粉经过自然发酵培养和粗酶液的制备,对其最强酶活力进行测定,得到:在168 h时,测得的蛋白酶活力最强,为1.811 U/ml;在144 h时,以CMC-Na为底物测得的纤维素酶活力最强,为0.287 U/ml;在192 h时,用FPA法测得的纤维素酶活力最强,为0.447U/ml。经过透析脱盐与冷冻干燥的简单纯化后,得到:蛋白酶的最终比活力为0.867 U/mg,纯化倍数为1.292倍;以CMC-Na为底物测得的纤维素酶的最终比活力为0.152 U/mg,纯化倍数为1.288倍;用FPA法测得的纤维素酶的最终比活力为0.219 U/mg,纯化倍数为1.273倍。此外,对酶的部分性质的测定中,蛋白酶反应的最适pH值和最适温度分别为pH 6.0和35℃。不同测定方法得到的纤维素酶的最适pH值和最适温度一致,分别为pH 4.5和55℃。并且两种酶均表现出较好的pH稳定性和热稳定性。几种金属离子对酶活性影响的分析结果表明:Na⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Al³⁺对蛋白酶的活力有激活作用,K⁺则起抑制作用。Ba²⁺对纤维素酶的活力有抑制作用,其它离子的影响程度均不明显。