背景:乳腺癌发病率在全世界女性肿瘤患者中居首位。目前有手术、化疗、内分泌治疗等多种手段可用于治疗乳腺癌,但即使对于那些在早期接受治疗的患者依然存在预后不良的问题。因此研究人员致力于开发新的靶点和治疗策略来改善患者预后,其中新型靶向药物细胞周期蛋白依赖性激酶4/6（cyclin-dependent kinases 4/6,CDK4/6）抑制剂联合内分泌疗法已成为雌激素受体（estrogen receptor,ER）阳性人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阴性乳腺癌的一线治疗手段。尽管目前乳腺癌个体化治疗已经取得了长足的进步,仍存在内分泌治疗单药耐药、缺乏新型治疗靶点等问题。肿瘤抑制因子p53是一种转录调节因子,在DNA损伤等应激条件下,p53可通过调控靶基因的表达来诱导细胞凋亡,从而抑制癌前细胞和恶性细胞的增殖。由于自身突变或p53负向调节因子MDM2的扩增,p53在人类癌症中常处于失活状态,这凸显了p53在抗肿瘤过程的关键作用。早有研究表明:可以通过基因手段恢复p53的功能,这已经在动物实验中表现出了显著的肿瘤抑制作用。因此激发了学术界重点开发能够重新激活p53小分子的药物以对抗癌症。瑞典卡罗琳斯卡医学院Galina Selivanova教授带领的研究小组筛选并鉴定的小分子RITA,可以在体内和体外触发不同来源的肿瘤细胞以产生p53依赖的凋亡,被认为是一种候选p53靶向药物。然而在RITA的临床前研究中发现,有效剂量的RITA可使大鼠、狗、猴等动物发生肺水肿,但小鼠却没有肺毒性的情况发生。有研究发现,小鼠的肺脏内缺乏磺基转移酶的表达。由此我们推测,大鼠、狗、猴的RITA肺毒性可能来源于磺基转移酶1A1（sulfotransferase1A1,SULT1A1）修饰后产物的非特异性毒性作用。进一步研究发现,RITA经SULT1A1修饰后产生的代谢物需要分子势能来完成进一步碳正离子的转化,而具有活性碳正离子可以与DNA发生生化反应,从而导致非特异性基因损伤。由于生物体内,如肺脏、肝脏、小肠、肾脏、大脑等器官广泛表达SULTs,我们进一步推测RITA也可能造成广泛的器官毒性。因此我们与美国国家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）的Wipf教授团队合作设计了具有高度选择特异性的RITA类似物。在前期药物量子力学分析中发现,相较于RITA,其类似物需要更高的势能才能完成磺化反应,这符合我们对RITA减少SULT1A1依赖性反应的预期。目的:在本研究中,探讨NSC777196和NSC782846两个RITA类似物的抗肿瘤作用及其机制,同时在TCGA数据库中筛选出可与内分泌治疗联合应用的低毒性p53激活药物—NSC782846的ER阳性乳腺癌高反应人群。旨在为未来开发可临床转化的高p53特异性和低毒性的RITA类似物奠定理论基础,同时为改善ER阳性乳腺癌患者治疗效果提供思路。方法:（1）通过CRISPR-Cas9基因编辑、相关敏感性分析、Western blotting技术及短期生存实验等方法,对比RITA及其类似物的抗癌活性对SULT1A1的依赖性。（2）通过CRISPR-Cas9基因编辑、q PCR及Western blotting技术,检测RITA类似物对相关致癌基因的抑制是否依赖于p53表达,且分析RITA及其类似物对相关致癌基因抑制的剂量依赖性及不同的调节机制。并通过短期及长期生存实验检测RITA类似物的抗癌活性对p53的依赖性。通过流式细胞术检测RITA类似物对肿瘤细胞凋亡的影响。（3）通过q PCR及Western blotting技术,检测在SULT1A1-/-细胞系中,RITA类似物对相关致癌基因的作用,利用慢病毒转导方法敲降p53后,RITA类似物对致癌基因影响的改变。通过流式细胞术检测RITA类似物对SULT1A1-/-肿瘤细胞凋亡的影响。（4）通过Western blotting及免疫荧光分析等方法,检测经RITA类似物处理后的SULT1A1-/-细胞中基因损伤标志物的表达水平;运用Western blotting及EU标记法检测RITA类似物对细胞转录的影响。（5）通过c Bio Portal网站获取不同ER状态下乳腺癌患者MDM2及MDM4基因的扩增情况,并分析它们的扩增突变与TP53基因突变的相关性。通过相关敏感性分析RITA类似物NSC782846的抗肿瘤活性与MDM2的相关性。（6）通过短期及长期生存实验检测RITA类似物NSC782846与他莫昔芬联合应用对雌激素受体阳性乳腺癌的协同抑制作用,并运用Calcu Syn软件计算这两种药物的联用指数。结果:（1）通过对NCI-60药物数据库分析发现,RITA、NSC777196及NSC78284对肿瘤细胞的生长抑制作用与SULT1A1表达量的相关性降低。利用7种不同来源肿瘤细胞系及课题组构建的稳定SULT1A1敲除及过表达细胞系,通过Western blotting及刃天青短期生存实验证实,RITA类似物较RITA的抗肿瘤活性对SULT1A1的依赖性降低,尤以RITA类似物NSC782846为著。（2）通过q PCR及Western blotting发现两种RITA类似物对相关致癌基因存在抑制作用,敲除p53后,这种抑制作用被抵消。RITA及其两种类似物对致癌基因的抑制作用存在剂量依赖性且调节方式不同。采用短期及长期生存实验证明了RITA类似物NSC782746对细胞的增殖抑制是依赖p53的。通过流式细胞术检测发现两种RITA类似物可诱发肿瘤细胞强烈凋亡。（3）通过q PCR及Western blotting证明,RITA类似物NSC777196和NSC782846在SULT1A1-/-细胞系中对相关致癌基因存在抑制作用,经慢病毒转导敲除p53后,这种抑制作用会被抵消。运用流式细胞术发现RITA类似物NSC782846在SULT1A1-/-细胞中诱导癌细胞凋亡,进一步证明了它的非SULT1A1依赖性。（4）利用MCF7 SULT1A1-/-细胞系,采用Western blotting及免疫荧光染色技术发现,RITA类似物NSC782846处理后细胞中γH2AX的蛋白相对表达量未见明显改变,而p53蛋白相对表达量上调。提示RITA类似物NSC782846 p53的激活机制与DNA损伤应激无关,即RITA类似物NSC782846通过无DNA损伤的方式激活p53发挥抗肿瘤作用。利用MCF7 SULT1A1-/-细胞系,经过Western blotting及EU标记法技术得出,RITA类似物NSC782846和NSC777196未阻断新生RNA的合成、未抑制RNA pol II的表达。提示RITA类似物在SULT1A1-/-细胞中的致癌基因抑制为p53介导的转录抑制,而非全基因转录阻断,即RNA类似物NSC777196和NSC782846通过非转录阻断的方式发挥抗肿瘤作用。（5）从c Bio Portal网站获取的1897乳腺癌患者信息,发现ER阳性乳腺癌患者的MDM2基因更易处于扩增状态,且MDM2的扩增与TP53基因突变互斥,提示了ER阳性乳腺癌患者可能成为RITA类似物NSC782846治疗的受益人群。通过对NCI-60药物数据库分析,发现RITA、RITA类似物NSC777196及NSC782846抗癌活性与MDM2的基线m RNA表达相关性依次升高,这表明干扰p53/MDM2的结合可能对NSC782846的抗肿瘤活性具有更重要的意义。（6）通过短期及长期生存实验发现,RITA类似物NSC782846与他莫昔芬联用可协同抑制ER阳性乳腺癌细胞,并利用Calcu Syn软件计算了两药联合指数CI＜1,证实了RITA类似物NSC782846与他莫昔芬联协同抑制效果。结论:（1）RITA类似物NSC777196及NSC782846在降低对SULT1A1依赖性的同时增高了对p53的特异性,尤以NSC782846为著,发挥抗肿瘤作用。（2）RITA类似物NSC777196及NSC782846激活p53靶基因并抑制相关致癌基因,通过直接激活p53,发挥抗肿瘤作用。（3）RITA类似物NSC782846不同于RITA及其类似物NSC777196,能在不导致DNA损伤和转录阻断的情况下,激活p53。（4）RITA类似物NSC782846降低SULT1A1依赖性,同时在不导致DNA损伤和转录阻断的情况下,激活p53,提示其细胞毒性较RITA低。（5）RITA类似物NSC782846与他莫昔芬联合应用能协同抑制ER阳性乳腺癌细胞。