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近几年来的研究表明,一些小的双链RNA分子可以通过作用于靶mRNA而抑制体内特定基因的表达,这种现象称为RNAi（RNA interference）即RNA干扰。自从1998年其机制被初步阐明以来,RNAi一直是分子生物学和遗传学的研究热点。它不仅是体内抵御外界感染的重要保护机制,还可以作为一种基因敲除工具用于遗传学的研究。而且由于RNAi与病毒RNA的密切关系,使得RNAi成为病毒防治的一种有效手段。 禽流感是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病,严重威胁世界各地的养禽业,常常造成巨大的经济损失,尤其是H5、H7亚型引起的高致病力禽流感是养禽业的一种毁灭性疾病。NP（nucleocapsid protein）、PA（polymerase PA）和PB1（polymerase subunit PB1）是禽流感病毒的重要的保护性抗原,而且都是保守性基因,适合作为RNA干扰实验的靶基因。 本文以禽流感H5N1病毒为实验对象进行RNAi研究,主要内容包括H5N1禽流感病毒的分离与鉴定,RNAi体外转录体系的构建和RNA干扰实验。 首先,从病死鸡的气管、肺、输卵管、肝、脾等组织中分离出一株病毒,该病毒可凝集鸡的红细胞,而且此凝集可以被禽流感的特异性血清所抑制。通过对分离株进行琼脂扩散、血凝实验、EID50、MDT（36h）、IvPI（3.5）等生物学试验、空斑试验及电镜观察等,证实该分离株为禽流感病毒高致病力的毒株H5N1。 在分离鉴定病毒株的基础上,根据禽流感H5N1的三个基因NP、PA和PB1设计了三对寡核苷酸oligo-NP、oligo-PA、oligo-PB1,并将它们连接到pBabe-Puro上,构建成功三条RNAi体外转录载体:pBabe-NP、pBabe-PA、pBabe-PB1。经过细胞转染后,用嘌呤霉素（puromycin）筛选出稳定转染细胞,病毒感染后进行Real-time PCR和Western Blotting实验,结果表明NP-siRNA和PA-siRNA明显抑制了病毒mRNA的合成和蛋白的表达。