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流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,对人群健康,社会稳定均产生重大影响。降低流感流行的最有效手段仍是接种流感疫苗,然而,由于流感病毒血清亚型众多,变异性强,因此设计开发安全的且可提供长久保护的,对多亚型流感共保护的新型流感疫苗势在必行。根据当前流感的流行现状和高致病性禽流感病毒跨种间传播的现状,本研究在本实验室已构建好的表位盒基础上,加以改进并合成了两个表位盒(H5亚型Th／B,CTL表位盒)。另外,采用基因串联的方式,构建了两种核酸疫苗质粒(pVAX1-NP-ECH5、PVAX1-H3-ETH5-H1HA1)。为了验证其能否用于进一步的体内试验,本研究以脂质体法转染BHK细胞,分别以RT-PCR和IFA对外源基因转录和蛋白表达及表达产物生物学活性进行了鉴定。结果显示RT-PCR均检测到外源基因的mRNA转录情况；IFA检测到了特异性荧光,说明表达产物具有相应的生物学活性。这说明各抗原组分可以在真核细胞中有效表达,为进一步动物实验免疫研究奠定了基础。本研究以小鼠模型作为哺乳动物模型,对之前构建的多表位核酸疫苗进行了免疫研究,对疫苗的免疫原性进行了评估。血清ELISA抗体检测结果显示：添加表位疫苗组(ThB、CTL表位)激发了与抗原单表达组相当的抗体水平,且并在H5亚型流感病毒特异性ELISA抗体水平显示了优势。细胞因子IL-4、IFN-γ检测结果显示：表位组分的加入显著上调了小鼠Th2细胞免疫功能,且CTL表位与NP串联免疫,可有效刺激了T淋巴细胞IFN-γ分泌。淋巴细胞转化试验结果表明：添加表位的DNA疫苗可刺激小鼠产生较强的特异性和非特异性增殖能力,免疫组小鼠的脾脏T淋巴细胞无论是特异性刺激指数还是非特异性刺激指数均明显高于对照组,且优于未添加表位DNA疫苗组。以上实验结果显示,本研究构建的以H3HA和H1HA1融合表达基因为骨架嵌合加入多表位基因的核酸疫苗,小鼠免疫实验显示,其不仅产生针对H3、H1 HA产生了特异性免疫应答(抗体和特异性细胞免疫),还增加了其抗H5亚型流感感染的可能性,为最终获得通用型流感病毒多表位基因工程疫苗进行了有意义的尝试。