RNAi介导抗WMV、ZYMV、CMV转基因甜瓜材料的研究

来源 :新疆农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dlj0425jack
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RNAi是指转入小片段双链RNA而引发目的基因表达沉默的现象,该现象可以抑制或减弱甜瓜病毒生理生化相关的基因表达,而达到抗病效果,本研究利用RNAi技术培育出转基因甜瓜苗,为了解新疆甜瓜上的抗病毒生理机制、抗病毒甜瓜的育种提供研究基础。本研究主要采用DNAMAN5.0、CLUSTAL X和MEGA5.O软件对新疆不同主栽区发生的WMV、CMV、ZYMV的cp基因进行序列比对,找出保守序列作为目标干扰片段,构建RNAi植物表达载体;利用农杆菌介导法将目的片段转入甜瓜,最终得到转基因甜瓜苗。本研究得出以下主要研究成果如下:(1)新疆不同地区WMV、ZYMA、CMVcp基因的碱基序列的同源性分别达到86.25%、93.37%、83.13%以上,同源相似性较高;通过进化关系分析表明WMV在南北疆均有分布,可分为2个亚组,第1亚组为南疆分离物,第2亚组为北疆分离物;CMV分为4个亚组,3株分离物与北京、山东、山西和台湾的进化关系较近;ZYMV可分为3个亚组,部分新疆分离物与3个国内外地区分离物的进化关系较近;新疆不同地区WMV、ZYMV、CMV cp基因均存在碱基突变现象。(2)建立WMV、ZYMV、CMV三种病毒多重RT-PCR反应体系(25μ1):模板cDNA最适体积为1.8μ1;引物总体积为2μ1时,比例WMV:CMV:ZYMV=9:6:5较合适;dNTPs最适浓度为0.4 mmol/L;Taq DNA聚合酶单位活力为0.75 U;Mg2+最适浓度为1.5 mmol/L;最适退火温度为50℃。(3)建立’XHXC’和‘86-1’两种甜瓜以子叶为外植体的组织培养与再生体系。5%NaClO的浓度下消毒20 min条件下获得无菌苗最好;‘86-1’和’XHXC’分别在6-BA浓度为1.2 mg/L和1.0 mg/L时愈伤的长势最好;在MS10培养基上的不定芽诱导率较高;MS19为‘86-1’的最适芽伸长培养基,MS20为’XHXC’的最适芽伸长培养基;MS24为两种甜瓜最适生根培养基。(4)经过分子检测最终得到‘86-1’甜瓜转pCAMBIA2300WMV-SA基因苗2株,转pCAMBIA2300CMV-SA基因苗2株,转pCAMBIA2300ZYMV-SA基因苗4株;’XHXC’甜瓜转pCAMBIA2300WMV-SA基因苗2株,pCAMBIA2300CMV-SA基因苗3株,pCAMBIA2300ZYMV-SA基因苗2株。
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