抑癌基因p53被誉为“基因组卫士”和“分子警察”,是人类癌细胞中突变频率最高的基因。p53可被多种胁迫信号激活,决定细胞的生与死,但p53蛋白到底如何精确调控纷繁复杂的下游信号通路,至今仍是一个未被完全解开的谜题。近年来发现p53存在众多异构体,对这些异构体蛋白功能的研究将有助于揭示p53信号途径调控的谜团。△113p53(斑马鱼)/△133p53(人)是N-端缺失的p53异构体,已有研究证明△113p53/△133p53具有拮抗p53介导的细胞凋亡功能,但其蛋白作用和分子机制并不清楚。本文第一部分工作将探讨△113p53/△133p53拮抗细胞凋亡的分子机制,挖掘△113p53/△133p53新的功能,具体结果如下：1)采用斑马鱼p53抗体Zfp53-N(只能识别全长p53)进行免疫共沉淀,利用另一个斑马鱼p53抗体Zfp53-A7C10(可识别全长p53和△113p53蛋白)检测沉淀蛋白,我们首次证实了内源性p53与△113p53可在DNA损伤条件下互作形成蛋白复合物。进一步构建△113p53蛋白寡聚结构域的单氨基酸突变体,我们找到两个丧失与p53蛋白结合能力的△113p53突变体。利用这两个突变蛋白,我们揭示了△113p53与p53的蛋白互作对于△113p53拮抗p53介导的细胞凋亡功能是必不可少的。2)通过在人的细胞系中过表达p53、△133p53或两者共同过表达,利用qRT-PCR技术检测代谢相关基因表达,我们发现△133p53能够抑制p53对Gls2、TIGAR和Sestrinl的转录激活作用,特别是谷氨酰胺酶Gls2基因,被显著下调一半。实验结果提示△133p53可能在抑制有氧代谢、促进糖酵解、促进细胞生长等信号途径中扮演重要角色。3)发现△113p53蛋白在野生型斑马鱼胚胎中能被γ-射线照射而非紫外线照射或热激诱导大量表达,深入研究表明△113p53可以通过直接结合到DNA双链损伤(DSB)修复相关基因如rad51、rad52和ligase4启动子中一些新型的反应元件,来促进它们的转录表达,首次证明了△113p53可独立于p53而发挥调控功能。本论文第二部分工作是构建体外染色体免疫共沉淀(in vitro ChIP)的新方法。p53是一个转录因子,到目前为止已超过1000多个基因被认为是它的目标基因。在不同胁迫条件下,以及同种胁迫不同程度下,它会启动不同基因转录。这种转录调节怎样实现仍未十分清楚,不过目前已有证据表明不同的p53异构体可以改变p53转录调控能力。通常不同压力条件会诱导多种p53异构体的表达,各种异构体比例也会动态改变,所以体内体系研究各种异构体之间的相互作用非常困难,我们拟建立一个体外染色体免疫共沉淀技术来探讨这类科学问题。本论文首先利用大肠杆菌表达纯化的蛋白和或有或无p53结合位点的两个不同质粒,摸索了p53蛋白体外特异性结合DNA最佳条件,随后利用这些条件将过表达HAp53 mRNA的斑马鱼胚胎细胞核提取物与超声破碎后的基因组DNA进行体外反应,无需交联即可用标签抗体直接进行免疫沉淀。后续用阳性引物qPCR扩增富集DNA证明了实验的成功,并且将这种方法收集DNA进行二代高通量测序(ChIP-seq),目前等待分析结果。此种方法的建立不仅对转录因子与DNA相互作用的研究具有重要的意义,更是为建立斑马鱼所有转录因子复杂调控网路提供了一个新型而便利的技术基础。