原肌球蛋白相关酪氨酸激酶(TrkA)受体在神经胶质瘤、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌细胞等一些细胞高表达,这些受体可以作为重要的癌症生物标志物。癌症生物标记为癌症风险评估,疾病的诊断、预防和监测提供工具,在研究中用于药物靶向治疗或潜在作用点。本研究采用富含TrkA受体的U251胶质瘤细胞作为潜在药物的靶点。通过U251细胞和活化硅球连接后形成富含TrkA受体的脂筏生物材料,并应用于抗肿瘤成分的在线筛选。寻找有效的抗肿瘤药物一直是全世界关注的热点。毋庸置疑,新的研究方向正转向为新型抗肿瘤先导化合物的鉴定,这对补充完善现有的抗肿瘤药物具有重要的作用。目前,临床所用60%的抗癌药物是从来源极其丰富的植物和天然产物中分离得到的。药用植物,由于具有极其多样的生化作用,成为大多数新型抗癌药化疗药物的主要来源。因此,新兴潜力植物的开发和生物医药新技术的应用有利于完善现有的研究领域。然而,天然产物成分复杂多样,治疗机制不明确,生物筛选系统有限,质量控制标准缺乏以及靶向特异性差等,这些因素都严重制约了从药用植物中获得的某些活性成分在肿瘤治疗领域的应用与发展。为了攻克这一难题,寻找涵盖多学科、技术和循证研究的先进理念的整体分析方法就十分必要。随着药物开发模式从单一靶点到多靶点的发展,中草药成为发掘多靶点的抗肿瘤化合物的研究热点。本研究构建的筛选系统在现有的基础上进行了长足改进,以便于筛选出更多具有多靶点抗肿瘤活性的天然组分。因此,本文旨在利用脂筏亲和色谱从两种具有抗肿瘤活性的中草药(天南星和王不留行)中寻找并鉴定抗肿瘤化合物。所选的两种中草药具有悠久的民族药用历史和广泛的药理活性,如抗肿瘤、抗菌、抗炎、调节血糖等,且二者在中国均具有广泛的分布范围。天南星的块茎通常用于镇痛、抗肿瘤和杀虫剂等方面,而其种子可用来活血化瘀、治疗闭经、促进乳汁分泌、愈合伤口以及治疗癌症等。植物化学研究表明天南星中富含生物碱、皂苷和萜类化合物。现有的研究表明王不留行的主要成分为黄酮苷类、环肽、三萜皂苷、类脂、脂肪酸和单糖等物质。本文研究的重点是利用脂筏生物定向筛选的方法从这两种中草药(天南星和王不留行)中分离和鉴定具有抗肿瘤活性的先导化合物,优化筛选条件,并进一步研究其抗肿瘤的作用机制。全文主要分为以下五部分：1.天然产物可作为新的抗肿瘤先导化合物的有效来源本部分内容对来源于天然产物的新型活性抗癌化合物,尤其是中国的中草药,成功用于癌症治疗的案例进行了简单的综述；对分离和鉴定这些化合物的方法进行了重点阐述；对抗肿瘤药物的现代筛选技术进行了总结。此外,对天然产物的有效部位,尤其是提取物及其制剂,进行积极的探索,并对多靶点抗肿瘤活性进行有力的陈述。本文利用脂筏硅胶固定相从用药价值、化学成分丰富和药理作用突出的两种中草药(王不留行和天南星)中筛选抗肿瘤活性成分为例说明进行阐述,为本文随后开展的研究提供了坚实的基础。2.脂筏生物定向筛选潜在抗肿瘤活性的药草本文选择了10种当地传统用于治疗癌症的中草药,利用脂筏亲和色谱进行快速筛选。主要内容包括：包含首先从胶质瘤U251细胞株中提取出的富含TrkA受体,并将其固定在活化的脂筏硅胶球表面；随后将该脂筏硅胶球固定装填于色谱柱性形成脂筏硅胶固定相(LRSB),并在线筛选不同中草药的抗肿瘤活性成分。本研究选用的两种潜在抗肿瘤活性中草药(天南星和王不留行)的乙醇提取部位在亲和色谱图上均有不同的保留行为。然后,采用脂筏亲和色谱对不同的活性部位(石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和萃余提取液)进行了进一步的筛选,确定正丁醇有效部位具有抗肿瘤活性。通过MTT法检测两种中草药的正丁醇活性部位对肝癌细胞的作用,发现均具有抗肿瘤活性。脂筏生物分析得到的数据与MTT实验结果保持一致。因此,确定两种中草药的正丁醇有效部位具有抗肿瘤活性,为后续抗肿瘤药物的分离、鉴定及其作用机制研究提供了物质基础。3.分离和鉴定具有抗肿瘤活性的化合物在本章节中,从天南星和王不留行中分离并充分鉴定得到了有抗肿瘤活性的化合物。采用多级提取、分离和纯化三水平的生物导向分离方法得到了活性化合物,采用核磁共振氢谱、碳谱、质谱以及文献信息对其结构进行了鉴定。其中鉴定得到具有显著抗肿瘤作用的化合物包括：从王不留行中分离得到的王不留行次皂甙E (vaccarosideE)、三萜皂甙类成分(segetoside H和segetoside Ⅰ)以及分子量为726、840、1071、1265、1390和1576的未知的化合物。通常,文献报道王不留行种子中分离得到的双糖链皂苷一直是抗肿瘤作用最显著的成分：然而,本研究发现一些环肽也具有类似的活性。活性最强的化合物(segetoside I, NC913, NC1482和NC1776)显示了广谱抗肿瘤作用,对多种人癌细胞细胞系(肝癌HepG2;申经胶质瘤U251；胃癌BGC, HGC & SGC;结肠癌Lovo-1)均显示出显著的毒性作用。这些化合物的抗肿瘤作用,尤其是双糖链皂苷,与其结构上的糖配基和不同的糖单位密切相关。天南星的有效成分也对HepG2显示出显著的毒性作用,其效果与5-氟尿嘧啶相当。对于天南星的提取物还需要进一步纯化分离,进一步发掘可能有效的抗肿瘤化合物。4.以得率为指标优选分离抗肿瘤活性先导化合物的提取工艺本研究中,实验结果显示从王不留行中分离得到的双糖链皂苷(CBS)是药用植物中最有效的抗肿瘤活性的化合物。由于活性抗肿瘤化合物分离的得率很小,这就大大限制了临床前研究和临床实验地广泛开展,所以,建立有效的提取模型以提高有效抗肿瘤化合物的得率为有效抗癌药物的开发铺平了道路。据前期研究发现,在本实验中与浸泡提取、超声辅助提取和热重通量提取方式相比较,微波辅助提取(MAE)的提取方法最佳。不同的提取方法对分离的化合物的质量没有显著影响。MAE最佳实验反应条件为：50%乙醇、40 mL/g(液/固比)、25 min、140 W微波功率,提取得率为0.765%；而最经济实用的反应条件为：40%乙醇、30 mL/g(液/固比)、10 min、100W微波功率,提取得率为0.729%。体外细胞实验结果表明,CBS中包含的主要成分vaccaroside E-1422、segetoside H-1448和segetoside Ⅰ-1464对HepG2肝癌细胞和SCG胃癌细胞显示出显著的体外细胞抗肿瘤活性,且作用明显优于临床抗癌药物5-氟尿嘧啶。结果表明MAE为分离提取CBS最有效的技术,且双糖链皂苷与王不留行抗癌作用相关。5.源自王不留行的植物双糖链皂苷Segetoside Ⅰ作用机制的基础研究本实验旨在说明segetoside Ⅰ对不同人癌细胞系(肝癌,HepG2;神经胶质瘤：U251；胃癌：BG、HGC、SGC;结肠癌：lovo-1)的抑制效果和可能的作用机制。因此,以不同浓度的segetoside Ⅰ分别作用于癌细胞,通过MTT法测定细胞存活率。采用Hoechst和AnnexinV/PI双染、流式细胞技术分别研究segetoside Ⅰ对肿瘤细胞的体外诱导凋亡机制。构建了HepG2细胞株裸鼠移植瘤模型,对segetoside Ⅰ的体内抑瘤活性进行了评价。MTT实验结果表明segetoside Ⅰ对HepG2细胞株的效果优于其他细胞,且对小鼠胚胎成纤维细胞的毒性较小。早期凋亡研究发现,segetoside Ⅰ可以导致HepG2细胞株的早期凋亡,DNA landder呈现剂量依赖关系,能抑制细胞迁移,使Bcl-2表达下调和Bax表达上调。Segetoside Ⅰ对肝癌小鼠几乎没有毒性,能作为治疗肿瘤的有效候选药物。以上实验结果表明Segetoside Ⅰ可以通过诱导细胞凋亡发挥其抗肿瘤活性,并进一步证实了segetoside Ⅰ是一种具有开发价值的抗肿瘤化疗药物。