论文部分内容阅读
目的：构建含人肝细胞生长因子（human hepatocyte growth factor， hHGF）基因的慢病毒载体，检测hHGF基因的mRNA和蛋白在293T细胞中的表达情况，为研究hHGF基因的功能奠定基础。方法：1．选择合适的酶切位点，将hHGF cDNA基因片段（包含有启动子和多聚腺苷酸A尾）从pUC-SRα-HGF载体酶切获取，平端连接入慢病毒载体pNL-EGFP，构建重组慢病毒载体pNL-hHGF-EGFP。2．将pNL-hHGF-EGFP转染293T细胞，应用RT-PCR、ELISA方法检测hHGF基因在293T细胞中的表达。3．将pNL-hHGF-EGFP与辅助质粒pHELPER、 pVSVG以一定比例共转染293T细胞，收集48h、72h病毒上清，经超滤浓缩后，测定病毒滴度，获得高滴度慢病毒颗粒。结果：1．hHGF cDNA基因片段正确的克隆到pNL-EGFP慢病毒载体上，电泳结果和酶切鉴定均能得到与理论大小相符合的片段，测序结果与Genebank序列完全一致。2．pNL-hHGF-EGFP转染293T细胞后绿色荧光蛋白有表达，转染24后RT-PCR检测到转染的293T细胞中hHGF基因mRNA表达，转染48h后细胞上清中HGF蛋白含量为52.72±13.09ng/ml。3．三质粒共转染293T细胞成功获得慢病毒，测得病毒的滴度为1.5×106TU/ml。结论：1．成功地构建了含有人HGF基因的慢病毒载体。2．pNL-hHGF-EGFP是具有表达功能的慢病毒表达载体。3．获得较高的病毒滴度，为其体内外研究提供基础。