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目的：
1.利用分子生物学技术,以AFP基因顺式作用元件(启动子和增强子)作为调节因子,构建肝细胞癌特异性镇痛抗肿瘤肽(Analgesic-antitumor peptide,AGAP)基因真核表达载体,利用计算机辅助分析和预测所表达蛋白质的理化和结构特征。
2.观察AGAP基因真核表达载体体外抗肝细胞肝癌作用,探索生物毒素靶向抗肝细胞癌作用。
方法：
1.提取东亚钳蝎总RNA,用RT-PCR法扩增出AGAP基因并电泳鉴定。
2.扩增含最短最有效AFP启动子和增强子组合真核表达载体pAFP,与目的基因双酶切后连接构建重组质粒,并经酶切及测序鉴定。
3.应用VectoR NTI软件对pAFP-AGAP序列进行读框(Ore)分析,用www.expasy.org网站提供的ProtParam方案以及DNAStar软件中的Protean程序进行蛋白理化性质分析,并将本实验重组质粒所表达的AGAP蛋白与GeneBank中AGAP蛋白进行二级结构、柔性、亲水性、抗原性、表位对比。
4.利用脂质体介导质粒转染,将pAFP-AGAP导入细胞中,并同时设对照组,通过RT-PCR检测细胞中AGAP mRNA的表达,CCK-8法检测细胞毒性作用并观察细胞形态学变化。
结果：
1.AGAP基因克隆成功,电泳大小与预期相符。
2.构建的AGAP基因真核表达载体pAFP-AGAP经酶切、测序证明构建正确。
3.通过生物信息学分析证实重组质粒pAFP-AGAP所表达的目的蛋白,在二级结构上没有变化,亲水性、抗原性等生物学活性也未受影响。
4.AFP阳性HepG2细胞转染质粒pAFP-AGAP24 h后仍正常生长,48 h后细胞开始出现肿胀、悬浮,72 h时细胞已基本悬浮,胞质中可见粗大颗粒和空泡；而AFP阴性HeLa细胞和L02细胞转染质粒后增殖正常,排列整齐。
5.各组细胞转染质粒pAFP-AGAP24 h、48 h和72 h后,仅AFP阳性HepG2细胞有AGAP mRNA表达,而AFP阴性的HeLa细胞和L02细胞均无AGAPmRNA表达
6.AFP阳性HepG2细胞转染质粒pAFP-AGAP48 h后,细胞生长与转染质粒pAFP的阴性对照组相比显著受抑(P<0.01),24 h、48 h和72 h时抑制率分别为2.4％、44.4％和74.6％,抑制作用随转染时间的延长而增强；而AFP阴性HeLa细胞和L02细胞生长均未受明显影响。
结论：
1.肝癌靶向性AGAP基因真核表达载体pAFP-AGAP构建成功。
2.重组质粒pAFP-AGAP设计合理,其所表达的目的蛋白很大程度保留了传统AGAP蛋白的生物学活性。
3.AFP基因顺式作用元件可以调控下游目的基因特异表达于AFP阳性细胞。
4.AFP基因顺式作用元件调控的毒性基因可以靶向性杀伤肿瘤细胞。