拟南芥三螺旋转录因子在盐胁迫反应中的功能研究

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盐胁迫严重影响了全球的农业生产,因此研究植物耐盐机理,对于在分子水平上改良农作物以提高其耐盐性有着深远的意义。转录因子对于目标基因的转录调控在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要的作用,三螺旋转录因子作为植物中特有的一类小的转录因子家族,在研究初期发现参与了对植物光应答的调控,后续研究发现这类转录因子也参与对植物生长发育、生物胁迫及非生物胁迫的调控,但这个家族基因参与盐胁迫的信号转导的机理还鲜有报道。本研究分析了拟南芥30个三螺旋转录因子基因对盐、旱、冷胁迫以及ABA和ethylene处理的应答模式,并从中选择了GT-4、GT-3a和GT-3b进行了深入的研究,希望进一步深化对拟南芥中三螺旋转录因子参与盐胁迫响应机理的认识。  qRT-PCR研究表明,GT-4的表达受到盐、旱胁迫和ABA、ACC等处理的诱导;GT-4在各种器官中广泛表达,在莲座叶片中的表达量最高,根中的表达量最低。与Col-0相比,gt-4突变体无论在1/2MS培养基上还是蛭石中对NaCl处理均是敏感的,而高表达GT-4的转基因株系对NaCl的处理表现出耐性;相对离子渗透率分析表明,NaCl处理后,gt-4突变体的相对离子渗透率明显高于Col-0植物,而高表达GT-4的转基因株系的相对离子渗透率低于Col-0植物,表明GT-4蛋白确实参与了植物盐胁迫的响应过程。我们还发现,正常生长情况下gt-4突变体的开花时间明显晚于Col-0植株,而高表达GT-4的转基因株系与Col-0植物开花时间没有显著差异。亚细胞定位结果表明该蛋白不仅定位在细胞核中,还定位在细胞质中。原生质体系统中的转录活性分析表明GT-4具有转录激活活性,并且N端的转录激活作用最为显著。DNA结合活性分析表明,GT-4蛋白可以与GT-3box、GT-3bbox和MRE4元件结合。同时,我们还检测了Col-0,gt-4突变体和GT-4高表达株系中一些胁迫和开花相关的基因的表达情况。结果表明,RD29A、RAP2.6L、COR15A、FT和SOC1的表达量在突变体中是被下调的,在转基因株系中上调,由此,我们认为GT-4蛋白可能是通过影响这些基因的表达来调控植物盐胁迫和开花的信号转导过程。此外,我们还借助酵母双杂交的方法筛选了与GT-4蛋白有相互作用的蛋白TEM2(AP2/ERF类转录因子)。研究发现,拟南芥中组成型高表达TEM2会导致植物严重的晚花的表型,但是TEM2参与的盐胁迫信号转导至今未有研究。因此,我们进一步探讨了GT-4与TEM2蛋白相互作用参与植物盐胁迫信号转导过程。首先,我们用BiFC和Co-IP的方法进一步验证了GT-4蛋白确实可以与TEM2蛋白在体内互作,并通过激光共聚焦显微镜观察,发现二者共定位在细胞核中。表型分析发现tem2突变体在NaCl处理时较野生型植株表现得更为敏感。我们认为,GT-4可能通过与TEM2互作参与调控植物盐胁的响应和开花过程。  对GT-3a和GT-3b也做了研究,发现GT-3a和GT-3b的表达受盐胁迫和ABA等处理的诱导,不同组织器官中,GT-3a在根中的表达量最高,GT-3b在根和莲座叶片中表达量较高。它们编码的蛋白均定位于细胞核,均具有转录激活活性。高表达GT-3a和GT-3b的转基因株系在NaCl处理时耐性明显优于Col-0植物。同时,我们还检测了Col-0,gt-3a突变体和GT-3a高表达株系中一些胁迫响应的基因的表达情况,结果表明,GT-3a影响了胁迫相关基因的表达。KIN1、RAB18、P5CS1、RD22、COR6.6、COR15A的表达量在突变体里下调,而在基因高表达株系中上调。我们认为,GT-3a可能通过影响这些基因的表达来调控植物盐胁迫的信号通路。通过酵母双杂交的方法,我们发现GT-3a与GT-3b不仅能自身形成同源二聚体还能彼此形成异源二聚体。此外,我们还筛选了与GT-3b有相互作用的蛋白RAP2.4,RAP2.4是转录因子,已有研究表明,拟南芥中高表达RAP2.4可以提高植物的耐旱性。我们推测GT-3b可能与RAP2.4互作来调控植物的耐逆能力。
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